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CCK8細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

來(lái)源:上海鹿森生物工程有限公司   2023年07月04日 14:23  

實(shí)驗(yàn)一:細(xì)胞增殖分析

1)制備細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)。
2)在96孔板中接種細(xì)胞懸液,每孔約100μl,同樣的樣本可做3個(gè)重復(fù)。
3)將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間(37℃, 5%CO2),細(xì)胞貼壁需要大約2-4h,如果是懸浮細(xì)胞,該步驟可以省去。
4)每孔各加入10μl CCK-8溶液,由于加入的CCK-8量比較少,可能會(huì)因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差,建議在加完試劑后輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板以幫助混勻,或者直接配置含10%CCK-8的培養(yǎng)基,以換液的形式加入。另外注意,加樣的過(guò)程中盡量不要產(chǎn)生氣泡。
5)將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育1-4h。因?yàn)榧?xì)胞種類不同,形成的formazan的量也不一樣,所以如果顯色不夠的話,可以延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,特別是血液細(xì)胞形成的formazan很少,需要較長(zhǎng)的顯色時(shí)間(5-6h)。
6)酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光值(OD)。
7)若暫時(shí)不測(cè)定OD值,可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,室溫下避光保存,這樣可以保證OD值在24h內(nèi)不發(fā)生變化。


實(shí)驗(yàn)二:細(xì)胞毒性分析

1)制備細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)。
2)在96孔板中接種細(xì)胞懸液,每孔約100μl,同樣的樣本可做3個(gè)重復(fù)。
3)將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間(37℃, 5%CO2),細(xì)胞貼壁需要大約2-4h,如果是懸浮細(xì)胞,該步驟可以省去。
4)向培養(yǎng)板各孔中加入不同濃度的毒性物質(zhì)(藥物、化學(xué)試劑等待檢測(cè)物質(zhì))。
5)將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育一段時(shí)間,例如6、12、24、48h,具體時(shí)間要看待測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性。
如果待檢測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性,可在加入CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基,以去掉待測(cè)物質(zhì)的影響。如果影響比較小或者沒(méi)有影響,可以不更換培養(yǎng)基,直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。
6)向每孔中加入10μl CCK-8溶液,由于加入的CCK-8量比較少,可能會(huì)因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差,建議在加完試劑后輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板以幫助混勻,或者直接配置含10%CCK-8的培養(yǎng)基,以換液的形式加入。另外注意,加樣的過(guò)程中盡量不要產(chǎn)生氣泡,以免影響OD值讀數(shù)。
7)將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育1-4h。因?yàn)榧?xì)胞種類不同,形成的formazan的量也不一樣,所以如果顯色不夠的話,可以延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,特別是血液細(xì)胞形成的formazan很少,需要較長(zhǎng)的顯色時(shí)間(5-6h)。
8)用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度(OD)。
9)若暫時(shí)不測(cè)定OD值,可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,室溫避光保存,這樣可以保證OD值24h內(nèi)不發(fā)生變化。

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