1.將兩種寡核苷酸各1μg加入微量離心管中,加水至17 μl,再加2 μl 的10×測序酶緩沖液。70℃加熱5 min,然后在合適的退火溫度下保溫5 min,取2 μl 留待以后的分析。
2.加2μl 4種dNTP混合液和10U測序酶,30℃溫育30min。
3.70℃ 10min 滅活DNA聚合酶,取2 μl 留待以后的分析。
4.加10×限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液,加水和20——100 U 的適合于克隆的限制性內(nèi)切酶至100 μl。適當(dāng)?shù)臏囟认孪? h以上。
5.酚抽提,加100 μl 4 mol/l 乙酸銨和400 μl的無水乙醇,-70℃沉淀15 min,離心5 min,沉淀重懸于100 μl TE緩沖液,用乙醇再沉淀一次,用95%乙醇洗滌沉淀,干燥,20 μl TE緩沖液溶解,取2 μl用于以后的分析。
6.用篩分型瓊脂糖凝膠電泳分析確證原材料、延伸產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物,估計延伸的寡核苷酸的量,再用適當(dāng)?shù)妮d體亞克隆。
7.對幾個合適的亞克隆測序。
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對其真實(shí)性負(fù)責(zé),不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時,必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。