什么是免疫組織化學(xué)

免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry), 是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理---抗原抗體反應(yīng), 即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理, 通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)), 對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究技術(shù)。

免疫組化將免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來, 借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用, 在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體及受體等)。

免疫組化標(biāo)本

實驗所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類, 前者包括石蠟切片和冰凍切片, 后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。

其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最-常-用、最基本的方法, 對于組織形態(tài)保存好, 且能作連續(xù)切片, 有利于各種染色對照觀察; 還能長期存檔, 供回顧性研究。石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響, 但可進(jìn)行抗原修復(fù), 是免疫組化中首-選的組織標(biāo)本制作方法。

免疫組化檢測方法

>>直接法

直接法又稱一步法, 采用帶標(biāo)記的抗體(如FITC)直接作用于組織切片上的抗原。該技術(shù)僅需一種抗體, 流程簡短、快速。但因為沒有信號放大系統(tǒng), 直接法靈敏度不高。隨著間接法的引入, 直接法應(yīng)用逐漸減少。

>>PAP法

PAP(peroxidase anti-peroxidase), 即過氧化物酶-抗過氧化物酶法。該法是間接法的進(jìn)一步改進(jìn), 涉及第三層過氧化物酶標(biāo)記的過氧化物酶抗體。該抗體與第二層未標(biāo)記抗體結(jié)合。因為過氧化物酶分子不是通過化學(xué)方法與IgG結(jié)合而是通過免疫結(jié)合, 故靈敏度高出100-1000倍。PAP法一抗的稀釋倍數(shù)增高, 可減少非特異性的背景染色。

>>ABC法

ABC(avidin-biotin-complex)代表的是親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物。利用親和素分別連接生物素標(biāo)記的第二抗和生物素標(biāo)記的酶。但是此法注意內(nèi)源性生物素活性的消除, 以減少非特異性的染色。

>>間接法

間接法涉及一個未標(biāo)記的一抗(第一層，直接跟組織抗原反應(yīng))和一個標(biāo)記的二抗(第二層, 與一抗反應(yīng))。因為二抗可跟一抗上多個不同的抗原位點結(jié)合, 放大信號, 從而提高了該法的靈敏度。當(dāng)二抗標(biāo)記上熒光染料, 如FITC、羅丹明、德克薩斯紅等, 即是間接免疫熒光法。當(dāng)二抗標(biāo)記上酶, 如過氧化物酶、堿性磷酸酶或葡萄糖氧化酶, 即是間接免疫酶法。

>>SP法

SP(streptavidin-perosidase)法, 即鏈親和素-過氧化物酶連結(jié)法, 是采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈親和素連接的過氧化物酶及底物色素混合液來測定細(xì)胞或組織中的抗原。鏈親和素是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì), 它能與各種動物的IgG的Fc段結(jié)合, 在免疫組化中可作為橋連抗體或標(biāo)記抗體。最大的優(yōu)點是不受種屬的特異性限制。此法還具有染色時間短、靈敏度高、背景染色淡等優(yōu)點, 分子量小, 易于穿透組織。

※ ABC法  VS SP法

ABC法的'三抗'是SABC復(fù)合物即鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物

SP法的'三抗'是過氧化物酶直接與鏈酶親和素相連的, 沒有通過生物素的中介連接

免疫組化常用染色方法

根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法、免疫酶標(biāo)法和免疫膠體金技術(shù)。

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