一、免疫印跡膜的介紹

在Western blotting實(shí)驗(yàn)中，NC膜和PVDF膜是最chang用的兩種膜。NC膜是特異性轉(zhuǎn)移介質(zhì)之一，使用范圍十分廣泛，也是最早用于Western blotting實(shí)驗(yàn)的膜。PVDF膜是在1985年開(kāi)發(fā)出來(lái)的，它能在比較苛刻的條件下(比如在酸性或堿性條件下，或者在有機(jī)溶劑存在時(shí))將蛋白保留，因此更廣泛用于Western blotting實(shí)驗(yàn)中。

二、作用機(jī)理的介紹

1.  NC膜

NC膜與蛋白質(zhì)之間是依靠靜電作用和疏水作用相結(jié)合的，NC膜屬于親水膜，使用前無(wú)需進(jìn)行預(yù)活化，使用方便、價(jià)格低廉、對(duì)蛋白質(zhì)的活性影響小、背景低；但其韌性較差，易損壞，從而不能反復(fù)使用，如果在非離子型去污劑作用下，結(jié)合上的蛋白比較容易被洗脫下來(lái)。

2.  PVDF膜

PVDF膜與蛋白質(zhì)之間是依靠疏水作用相結(jié)合的，與NC膜相比，PVDF膜有著ji好的化學(xué)穩(wěn)定性和更高的機(jī)械強(qiáng)度，適合反復(fù)檢測(cè)（reprobing）和多次剝離（stripping）。PVDF膜需要先用甲醇潤(rùn)濕后才能被常規(guī)的轉(zhuǎn)膜液所浸潤(rùn)，轉(zhuǎn)印緩沖液中添加的Ca2+離子能夠增強(qiáng)鈣調(diào)蛋白與Immobilon®-P轉(zhuǎn)印膜的結(jié)合，鈣的結(jié)合使蛋白質(zhì)分子形成一個(gè)疏水袋結(jié)構(gòu)，從而增加蛋白與膜的結(jié)合。此外，PVDF膜具有更高的蛋白結(jié)合能力，一般NC膜的結(jié)合能力是80-100μg/cm2，而PVDF膜可以達(dá)到150-160μg/cm2。因此，PVDF膜已成為現(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)室WB的常用膜。

三、PVDF膜使用須知

1. PVDF膜為什么需預(yù)先活化？

PVDF膜本質(zhì)上是一種疏水性的聚合物，不帶電荷并具有疏水性，不能被常規(guī)轉(zhuǎn)膜液所浸潤(rùn)，為了在水性緩沖液中使用，需要在使用前進(jìn)行預(yù)處理以浸潤(rùn)和活化膜。最chang用的方法是使用50%（v/v）或更高濃度的醇（甲醇、乙醇和異丙醇）溶液進(jìn)行浸潤(rùn)和活化，使得PVDF膜中微孔內(nèi)的空氣能夠被低表面張力的甲醇所替代，從而易于后續(xù)緩沖液進(jìn)入PVDF膜中的微孔內(nèi)，使得PVDF膜從疏水性轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性，在浸潤(rùn)過(guò)程中膜的外觀會(huì)從不透明轉(zhuǎn)變?yōu)榘胪该?，此時(shí)表明PVDF膜已被wan全浸濕。然后用水反復(fù)沖洗以去除醇類(lèi)，再直接將膜放入轉(zhuǎn)印緩沖液中進(jìn)行平衡。膜被浸濕后，通過(guò)電轉(zhuǎn)移，蛋白質(zhì)與膜接觸發(fā)生疏水作用而被吸附在PVDF膜上。

2. PVDF膜孔徑對(duì)蛋白結(jié)合的影響？

膜孔徑越小，膜對(duì)低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固。首先，較小的孔徑會(huì)限制蛋白分子的運(yùn)動(dòng)，減緩其轉(zhuǎn)移速度，蛋白與膜的結(jié)合就更充分，從而更容易被攔截在孔道內(nèi)；其次，較小的孔徑還能提供較大的膜表面積，從而提高了蛋白與膜接觸的機(jī)會(huì)；此外，較小的孔徑也能提供更高的表面密度，從而增加了孔道與溶液間的分子間吸引力，這種吸附方式被稱(chēng)為“毛細(xì)作用”。Schweitzer和Kriz在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，較小的孔徑可以增強(qiáng)其吸附能力并提供更高的蛋白密度，蛋白分子量越低，蛋白的比表面積越大，與膜接觸面越大越充分，結(jié)合就更緊密。但是，如果膜的孔徑小于0.1 μm，那么蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進(jìn)行下去了，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子的直徑大約在1-100 nm之間。

3. 如何選擇PVDF膜？

一般情況下，分子量大于20kD的蛋白應(yīng)選擇0.45μm的膜，分子量小于20kD的蛋白應(yīng)選擇0.2μm的膜。0.2μm的PVDF膜內(nèi)部表面積大約是0.45μm的PVDF膜的三倍，因此其吸附能力更高。總之，選擇PVDF膜的孔徑大小需要根據(jù)樣品蛋白的特性和大小來(lái)確定，以期獲得最佳的結(jié)合效果。

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