如何利用流式進(jìn)行細(xì)胞凋亡(Cell Apoptosis)分析
磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)是一種細(xì)胞膜活性物質(zhì),正常細(xì)胞中,其位于細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層內(nèi)側(cè),在細(xì)胞凋亡的早期,PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面。
凋亡早期:磷脂膜(PS)外翻,但是細(xì)胞膜保持完整性,因此PI(與DNA結(jié)合)染色為陰性。Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,可以與凋亡早期外翻的磷脂膜(PS)結(jié)合。
凋亡中晚期:磷脂膜(PS)外翻,但是細(xì)胞膜被破壞,Annexin V和PI分別與磷脂酰絲氨酸和DNA結(jié)合。
壞死細(xì)胞:沒有細(xì)胞膜,PI與DNA結(jié)合。
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:
FITCAnnexin V Apoptosis Detection Kit I
二、樣本設(shè)置:
1. 空白對(duì)照:輔助判斷管,即不加Annexin V/PI,但用它調(diào)電壓的話,電壓偏高,即根據(jù)它確定的陰陽(yáng)性界限是偏低的。
2. 陰性對(duì)照:未誘導(dǎo)的,Annexin V/PI雙染,細(xì)胞絕大部分都在雙陰性區(qū)域,用它來確定兩熒光通道的電壓,這是為了排除非特異性結(jié)合。
3. 單陽(yáng)樣本:誘導(dǎo)凋亡,Annexin V單染,用來調(diào)補(bǔ)償。
4. 單陽(yáng)樣本:誘導(dǎo)凋亡,PI單染,用來調(diào)補(bǔ)償。
三、實(shí)驗(yàn)步驟:
1.收集細(xì)胞,用冷的PBS洗兩次,之后用1X binding buffer (PBS稀釋)重懸細(xì)胞(1X10^6/ml);
2.吸取100ul細(xì)胞懸浮液放入新的離心管中,:1)PITC和PI都不染的細(xì)胞 2)只染FITC Annexin V(no PI) 3)只染PI(no FITC Annexin) 4)都染的細(xì)胞(FITC和PI都加5ul)
3.輕輕震蕩混勻,黑暗處室溫(25℃)孵育15mins;
4.最后加入400ul 1X binding buffer,一個(gè)小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。
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