核酸作為一切分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ),其提取通常是開(kāi)啟生物學(xué)研究的第一步,而且提取的核酸質(zhì)量高低也是決定下游實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素之一。常見(jiàn)的核酸提取方法有酚氯仿抽提法、高鹽沉淀法、柱式法和磁珠法,其中,磁珠法核酸提取都分為哪幾個(gè)步驟?讓我們一起來(lái)看看吧!
第一步:裂解
核酸必須從細(xì)胞或其他生物物質(zhì)中釋放出來(lái),細(xì)胞裂解可通過(guò)機(jī)械作用、化學(xué)作用、酶作用等方法實(shí)現(xiàn)。其中,酶作用主要是通過(guò)加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈霉蛋白酶)以使細(xì)胞破裂,核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì),促進(jìn)核酸的分離。
第二步:結(jié)合
磁珠表面帶負(fù)電荷,磁珠buffer是高鹽環(huán)境有帶正電荷的鹽離子,樣本被buffer影響,磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷。
第三步:洗滌
核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等其他生物大分子物質(zhì)更具親水性,根據(jù)它們理化性質(zhì)的差異,用選擇性沉淀、層析、密度梯度離心等方法可將核酸分離、純化。
用無(wú)水乙醇沉淀DNA,這是實(shí)驗(yàn)中最chang用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶,乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng),對(duì)DNA很安全,因此是理性的沉淀劑。當(dāng)加入乙醇時(shí),乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子,使DNA失水而易于聚合。
第四步:洗脫
加水或者EB破壞高鹽環(huán)境,形成低鹽環(huán)境,使DNA從磁珠上脫落。
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