由于二代測序讀長的限制,不可能一下將一個很長的基因序列測通,因此需要先將長基因序列隨機片段化成小片段,這樣的話,這些片段就可以覆蓋整個基因組。所以需要構建文庫。
一、文庫構建的步驟
文庫構建大致步驟類似,但是各有各自du特的點,例如,RNAseq里miRNA,lncRNA,mRNA方法各有差異,具體方法以后有機會再補充。這里以Illumina的 PE文庫為例,其流程圖如下圖。
二、文庫構建詳細步驟
(1)DNA片段化 (Fragment DNA)
使用超聲、酶或者加熱的方式將DNA樣品打碎成小片段,一般在300 ~ 800bp之間除非有特殊要求。
(2)末端修復(End Repair)
補平片段化時導致的不平末端。
(3)3' 末端加“A” (A-tailing)
3‘ 末端加A,轉換為粘性末端,與adapter 互補配對,因為adapter 3‘端有一個突出的T。
(4)接頭連接( ligation adaptor)
這一步有兩種不同的添加策略如下圖。
左邊的圖是直接在fragment DNA的兩端直接加上full Y-adapter, adapter中已經(jīng)包括了和P5/P7 oligo互補的序列, index, 以及Read1/Read2的測序引物。
右邊的圖是先在fragment DNA的兩端加上PE adapter, 然后再引入和P5/P7 oligo互補配對的序列以及index序列,分兩步:
A. PE adapter添加利用堿基互補配對的原則,加上PE adapter。PE adpater中一部分是建庫PCR富集時候需要用的引物序列,另一部分是測序時需要用的引物。
B.PCR 添加 index,P5,P7
Index也稱barcode,用來區(qū)分不同樣本的文庫,因為測序儀一個lane產(chǎn)生數(shù)據(jù)量若干Gb,為了最da化利用測序儀,一次上機常會進行多個樣本文庫混合測序,在后續(xù)分析時,Index用來區(qū)分數(shù)據(jù)是來自哪個樣本。
● PCR富集目的片段
進行PCR擴增,循環(huán)數(shù)與投入的DNA量有關,使得文庫達到上機濃度。
● 擴增文庫大小質檢
使用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測。
● 文庫濃度定量
Qubit3.0 進行初步定量 Q-PCR對文庫的有效濃度進行準確定量,至此文庫構建結束。
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