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NGS測(cè)序之文庫(kù)構(gòu)建

來源:北京百奧創(chuàng)新科技有限公司   2023年08月24日 10:55  

由于二代測(cè)序讀長(zhǎng)的限制,不可能一下將一個(gè)很長(zhǎng)的基因序列測(cè)通,因此需要先將長(zhǎng)基因序列隨機(jī)片段化成小片段,這樣的話,這些片段就可以覆蓋整個(gè)基因組。所以需要構(gòu)建文庫(kù)。

一、文庫(kù)構(gòu)建的步驟

文庫(kù)構(gòu)建大致步驟類似,但是各有各自du特的點(diǎn),例如,RNAseqmiRNA,lncRNA,mRNA方法各有差異,具體方法以后有機(jī)會(huì)再補(bǔ)充。這里以IlluminaPE文庫(kù)為例,其流程圖如下圖。

6-2.png


二、文庫(kù)構(gòu)建詳細(xì)步驟

1DNA片段化 (Fragment DNA

使用超聲、酶或者加熱的方式將DNA樣品打碎成小片段,一般在300 ~ 800bp之間除非有特殊要求。

2末端修復(fù)(End Repair

補(bǔ)平片段化時(shí)導(dǎo)致的不平末端。

33' 末端加“A” A-tailing

3‘ 末端加A,轉(zhuǎn)換為粘性末端,與adapter 互補(bǔ)配對(duì),因?yàn)?/span>adapter 3‘端有一個(gè)突出的T。

4)接頭連接( ligation adaptor

這一步有兩種不同的添加策略如下圖。

6-3.png

左邊的圖是直接在fragment DNA的兩端直接加上full Y-adapter, adapter中已經(jīng)包括了和P5/P7 oligo互補(bǔ)的序列, index, 以及Read1/Read2的測(cè)序引物。

右邊的圖是先在fragment DNA的兩端加上PE adapter, 然后再引入和P5/P7 oligo互補(bǔ)配對(duì)的序列以及index序列,分兩步:

A. PE adapter添加利用堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則,加上PE adapter。PE adpater中一部分是建庫(kù)PCR富集時(shí)候需要用的引物序列,另一部分是測(cè)序時(shí)需要用的引物。

B.PCR 添加 index,P5P7

Index也稱barcode,用來區(qū)分不同樣本的文庫(kù),因?yàn)闇y(cè)序儀一個(gè)lane產(chǎn)生數(shù)據(jù)量若干Gb,為了最da化利用測(cè)序儀,一次上機(jī)常會(huì)進(jìn)行多個(gè)樣本文庫(kù)混合測(cè)序,在后續(xù)分析時(shí),Index用來區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)是來自哪個(gè)樣本。

      PCR富集目的片段

進(jìn)行PCR擴(kuò)增,循環(huán)數(shù)與投入的DNA量有關(guān),使得文庫(kù)達(dá)到上機(jī)濃度。

擴(kuò)增文庫(kù)大小質(zhì)檢

使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的insert size進(jìn)行檢測(cè)。

文庫(kù)濃度定量

Qubit3.0 進(jìn)行初步定量 Q-PCR對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量,至此文庫(kù)構(gòu)建結(jié)束。

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