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高濃度胰島素試劑盒專門用于定量高濃度細胞上清液樣品中的胰島素，無需執(zhí)行稀釋步驟。
概述
在測定中對胰島素進行定量之前，通常需要稀釋高度濃縮的樣品。該 HTRF 高范圍試劑盒無需清洗步驟，動態(tài)范圍為 4 對數(shù)，可實現(xiàn)更低的樣品稀釋度和更高的準確度，從而實現(xiàn)簡單可靠的胰島素定量。
測定原理:使用兩種單克隆抗體的夾心免疫測定法測量胰島素，一種用 Cryptate（供體）標記，另一種用 XL665（受體）標記。獲得的 FRET 信號強度與樣品中胰島素的濃度成正比。
檢測方案:5 µL 細胞上清液補充有 50 µL 受體標記抗體和 25 µL 供體標記抗體（或單個分液步驟中補充 75 µL 預混合試劑）。然后將混合物在室溫下孵育 4 小時至過夜，并在 HTRF 兼容讀取器上讀取結果。
HTRF 高范圍胰島素測定顯示與人胰島上清液中的 RIA 具有好的相關性。回歸線的斜率為 0.9，接近理想線，證明了測定的可靠性。
對小鼠和大鼠 B 細胞的驗證:將 MIN6 小鼠 ?-細胞和 INS-1E 大鼠 ?-細胞接種到 24 孔板中（500 µL 培養(yǎng)基中，每孔 400,000 個細胞），然后在 37°C - 5% CO2 的全培養(yǎng)基中培養(yǎng) 6 天。刺激前，用 KRB 緩沖液洗滌細胞，并在 KRB 緩沖液（不含葡萄糖）中于 37°C 進行細胞靜止步驟 2 小時。用 250 µL 含有濃度不斷增加的葡萄糖的 KRB 緩沖溶液刺激細胞。MIN6 細胞分泌 10 分鐘和 30 分鐘后，或 INS-1E 細胞分泌 2 小時后，收集細胞上清液*并使用 HTRF 檢測試劑對胰島素進行定量。每個處理條件一式三份進行測量（誤差線代表SEM）。
大鼠胰島驗證:將雄性 Wistar 大鼠新鮮分離的胰島在含有 2.8 mM 葡萄糖（非刺激性基礎條件）或 8.3 mM 葡萄糖（刺激性條件）的 KRB 緩沖液中于 37°C 孵育 30 分鐘（5 個胰島/管；4 管/健康）狀況）。孵育期結束時，收集上清液*并使用胰島素高范圍試劑盒測定胰島素濃度。
* 樣品由法國蒙彼利埃大學糖尿病藥理學實驗室、Max Mousseron 生物分子研究所 (IBMM)、CNRS UMR-5247 藥學院慷慨提供
對離體灌注大鼠胰腺的驗證:用含有 1.5 g/L 葡萄糖 +/- 10 µM 槲皮素的 KRB 緩沖液灌注從雄性 Wistar 大鼠中分離的胰腺。向培養(yǎng)基中連續(xù)通入 95% O2 ± 5% CO2 并保持在 37.5°C。選擇恒定壓力以提供 2.5 至 3.3 mL/min 之間的流速。隨著時間的推移收集流出液*（13 個部分），并使用試劑盒試劑測量胰島素濃度。
* 樣品由法國蒙彼利埃大學糖尿病藥理學實驗室、Max Mousseron 生物分子研究所 (IBMM)、CNRS UMR-5247 藥學院慷慨提供
對人類胰島的驗證:將來自 3 個人胰腺（A、B 和 C）的胰島置于 24 孔板中（50 個胰島/孔，3 孔/條件），并在含有 2.8 mM 葡萄糖的 KRBH 緩沖液中于 37°C 預孵育 1 小時。孵育延長一小時并收集上清液以測量基礎胰島素分泌。接下來用 16.7 mM 葡萄糖在 37°C 下刺激胰島 1 小時，然后收集上清液以測量葡萄糖刺激的胰島素分泌。然后用酸-乙醇溶液裂解胰島24小時，收集裂解物并離心。使用胰島素高范圍試劑盒試劑對上清液*和裂解物*中的胰島素進行定量。
* 樣本是在法國蒙彼利埃大學醫(yī)院再生醫(yī)學和生物治療研究所 (IRMB) 糖尿病細胞治療實驗室生成的。
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