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EMSA（電泳遷移率變動(dòng)測(cè)定）用于研究蛋白質(zhì)：DNA 復(fù)合物和相互作用。蛋白質(zhì)：DNA 復(fù)合物在非變性凝膠上比未結(jié)合的線性 DNA 遷移得更慢，從而導(dǎo)致“移位”。
EMSA 也稱為“凝膠位移”或“凝膠阻滯”測(cè)定，可用于分析蛋白質(zhì)對(duì)核酸的序列特異性識(shí)別。
圖 1. EMSA/凝膠位移測(cè)定圖。當(dāng)添加摩爾過量的未標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)DNA時(shí)，遷移率變化會(huì)大大降低。熒光標(biāo)記的 IRDye 700 寡核苷酸探針用于檢測(cè)。 IRDye 700 寡核苷酸在兩條鏈上均進(jìn)行末端標(biāo)記。
近紅外熒光的優(yōu)點(diǎn)
近紅外熒光 EMSA 為放射性 EMSA 技術(shù)提供了安全、靈敏的替代方案。
您可以輕松地將傳統(tǒng)的放射性 EMSA 協(xié)議應(yīng)用于無害的近紅外熒光 EMSA 檢測(cè)。使用 IRDye ®末端標(biāo)記的寡核苷酸并使用 Odyssey ® CLx 紅外成像儀或 Odyssey 經(jīng)典紅外成像儀進(jìn)行成像。使用近紅外熒光，您可以在不到 2 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行測(cè)定并獲得結(jié)果，而使用其他方法則需要幾個(gè)小時(shí)或過夜。
使用近紅外熒光技術(shù)的 EMSA 用于研究：
轉(zhuǎn)錄調(diào)控
DNA復(fù)制
DNA修復(fù)
RNA加工
圖 2.EMSA/凝膠位移測(cè)定。 IRDye 700 EMSA 使用共有寡核苷酸針對(duì) 3 個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄因子靶點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試。箭頭表示移動(dòng)性轉(zhuǎn)變的位置。
您可以檢測(cè)濕凝膠中的蛋白質(zhì)：DNA 復(fù)合物，無需凝膠干燥或膠片曝光。如果需要，您可以在 Odyssey 掃描儀表面上對(duì)盒中的凝膠進(jìn)行成像，以評(píng)估凝膠是否運(yùn)行了足夠長(zhǎng)的時(shí)間，如果沒有，請(qǐng)將其放回腔室中以進(jìn)一步進(jìn)行電泳。
即用型標(biāo)記寡核苷酸 可用于各種常見的共有序列。其他 IRDye 末端標(biāo)記寡核苷酸和定制寡核苷酸可通過Integrated DNA Technologies (IDT)、TriLink BioTechnologies或Metabion International AG 獲得。
圖 3. 使用 IRDye 700 AP-1 寡核苷酸雙鏈體的 AP-1 EMSA。用血清處理的 HeLa 細(xì)胞的核提取物用于觀察血清刺激后 AP-1 結(jié)合增加的情況。競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)含有 100 倍摩爾過量的未標(biāo)記寡聚雙鏈體。箭頭表示熒光寡核苷酸的遷移率變化。星號(hào)表示由于過量未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手 DNA 引起的遷移率變化的減少。使用 Odyssey Classic 紅外成像儀對(duì)濕凝膠進(jìn)行成像。
紅外熒光EMSA與其他方法的比較
比較 EMSA 檢測(cè)方法，了解如何使用紅外檢測(cè)提高安全性并節(jié)省時(shí)間。
| IRDye ®紅外熒光染料 | 放射性同位素 | 生物素/鏈霉親和素（例如 Thermo Scientific LightShift） |
|---|---|---|
| 總時(shí)間： 1.5小時(shí) | 總時(shí)間： 4.5 – 24 小時(shí) | 總時(shí)間： 4.5 – 5 小時(shí) |
| 輕松獲取和處置 | 監(jiān)管限制、處置麻煩和成本 | 聯(lián)系制造商了解詳情 |
| 熒光寡核苷酸具有更長(zhǎng)的穩(wěn)定性 | 標(biāo)記寡核苷酸的半衰期短 | 化學(xué)發(fā)光信號(hào)不穩(wěn)定 |
| 無危險(xiǎn) | 危險(xiǎn)的 | 聯(lián)系制造商了解詳情 |
| 濕凝膠成像，無需移除凝膠板 | 需要凝膠干燥和膠片/熒光屏曝光 | 需要進(jìn)行膜轉(zhuǎn)移 |
| 快速、方便、直接檢測(cè) | 耗時(shí)、檢測(cè)不方便 | 間接檢測(cè)方法。需要封閉、鏈霉親和素孵育和洗滌 |
| 如果需要，可以更換凝膠并延長(zhǎng)運(yùn)行時(shí)間 | 凝膠運(yùn)行時(shí)間無法延長(zhǎng) | 凝膠運(yùn)行時(shí)間無法延長(zhǎng) |
| 不到 2 小時(shí)即可得出結(jié)果 | 通常要到第二天才能獲得結(jié)果 | 檢測(cè)步驟使協(xié)議增加了幾個(gè)小時(shí) |
典型 EMSA 工作流程
準(zhǔn)備反應(yīng)并孵育20-30日 分鐘
通過非變性電泳分離
使用 Odyssey Imager 進(jìn)行圖像凝膠并分析
*如果需要，請(qǐng)重復(fù)步驟 3 并再次成像。
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