免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,制成熒光抗體,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。那么你知道在免疫熒光(IF)實驗中會遇到那些問題以及這些問題的解決方法嗎?讓我們一起來看看吧!
問題一:目標(biāo)蛋白熒光很弱,導(dǎo)致組間差異不顯著,導(dǎo)致假陰性結(jié)果
解決方案:出現(xiàn)這種情況后,首先檢查抗體是否正確,是否適用于預(yù)處理的組織。有些抗體只適用于冰凍切片,但如果應(yīng)用于石蠟切片,則會出現(xiàn)弱標(biāo)記或無標(biāo)記現(xiàn)象。然后通過文獻(xiàn)了解目的蛋白在組織或細(xì)胞中的表達(dá)豐度。此外,如果抗體修復(fù)不足,抗原表位未完quan暴露,也會出現(xiàn)弱標(biāo)記。例如,雖然大多數(shù)抗體在酸性環(huán)境中修復(fù),但也有少數(shù)抗體需要在堿性環(huán)境中修復(fù)。建議查看抗體說明書,嚴(yán)格按照其修復(fù)條件進(jìn)行實驗。
問題二:目標(biāo)蛋白的熒光過強,甚至形成非特異性的標(biāo)記,一些背景染色可能被誤認(rèn)為陽性區(qū)域,造成假陽性結(jié)果
解決方法:適當(dāng)降低一抗或者二抗的濃度,增加漂洗時間,一般能夠有所改善
問題三:DAPI 染細(xì)胞核時,加入的試劑太多,造成高背景染色
解決方法:滴加的 DAPI 不要太多,只需覆蓋上薄薄的一層即可。
問題四:組織切片預(yù)處理不當(dāng)或采用石蠟切片,導(dǎo)致高背景染色
解決方案:如果組織切片,尤其是石蠟切片脫蠟環(huán)節(jié)不徹di,也會造成區(qū)域性的非特異性標(biāo)記。建議脫蠟一定要徹di,脫蠟前充分烤片也可以幫助脫蠟。實驗過程中,玻片干燥了,同樣會造成高背景或大面積的非特異性標(biāo)記。漂洗環(huán)節(jié)和抗體孵育環(huán)節(jié)最容易出現(xiàn)干片現(xiàn)象,尤其是大批量實驗時,一定要注意。使用免疫組化專用筆畫個圈,可以有效改善。
問題五:采集圖像過程不當(dāng),導(dǎo)致原始圖像不佳,直接影響后續(xù)半定量分析
解決方案:采集圖像時不要對每一張圖像都加上標(biāo)尺,否則后期采用 Image J或者 IPP 進(jìn)行分析時,這些標(biāo)尺會對結(jié)果造成影響。采集圖像時,速度要快。如果激發(fā)光很長時間對準(zhǔn)目標(biāo)區(qū)域,此區(qū)域內(nèi)的熒光衰減會極快因此,目標(biāo)區(qū)域較小時,一定要盡量快速采集,減少人為實驗誤差。
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