PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。PCR中通常需要兩種引物。一種與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補, 另—種與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補。PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。引物是PCR特異性反應的關鍵,因此,PCR的首要任務就是引物設計。引物設計的好壞,直接影響了PCR的結(jié)果。成功的PCR反應既要高效,又要特異性擴增產(chǎn)物。那么PCR引物設計的原則有哪些呢?讓我們一起來看看吧!
引物設計的目的是在兩個目標之間取得平衡:擴增特異性和效率。因此,引物的設計需要遵循以下原則
一、引物長度要適宜
一般,引物的長度為15-23bp,常用的長度為18-21bp。過長會導致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq 酶進行反應。過短則特異性差。
二、引物GC含量要適宜
1.引物3'端的堿基一般不用A,因為A在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)效率相對比較高, 而其它三種堿基的錯誤引發(fā)效率相對小一些。
2.3'端防止連續(xù)三個C或G,引物的GC含量一般為45-55%,過高或過低都不利于引發(fā)反應。
3.上下游引物的GC含量不能相差太大。
三、引物自身及引物之間不應存在互補序列
堿基要隨機分布,且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體,從而影響引物與模板的復性結(jié)合。
四、引物5'端可以修飾,3'端不可修飾
1引物的5' 端決定著PCR產(chǎn)物的長度,它對擴增特異性影響不大。因此,可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5'端修飾包括:加酶切位點,加標記熒光,引入點突變、插入突變、缺失突變序列;引入啟動子序列等。
2引物的延伸是從3'端開始的,不能進行任何修飾。
3在引物的5`端連接一對限制酶的識別序列,這樣便于目的基因連接到載體上。
五、退火溫度要適宜
退火溫度高,擴增特異性強;退火溫度低,擴增效率高。
原因:如果引物堿基數(shù)較少,可以適當提高退火溫度,這樣可以使PCR的特異性增加;如果堿基數(shù)較多,那么可以適當減低退火溫度,使DNA雙鏈結(jié)合。一對引物的退火溫度相差4℃~6℃不會影響PCR的產(chǎn)率,但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的。
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