280nm的光吸收法:
用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0 mg/mL。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白(BSA)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定:
取6支試管，按下表編號(hào)并加入BSA(1.0 mg/mL)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，用蒸餾水補(bǔ)體積至5.0 mL;測(cè)定A280 :用第1管為空白對(duì)照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度A280，以A280為縱坐標(biāo)，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線。
利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的A280值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。
280 nm和260 nm的吸收差法：
核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280 nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍(每克)，但核酸在260 nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在260 nm附近。核酸260 nm處的消光系數(shù)是280 nm處的2倍;而蛋白質(zhì)則相反，其280 nm的紫外吸收值大于260 nm的吸收值。通常:
純蛋白質(zhì)的光吸收比值:A280/A260 =1.8
純核酸的光吸收比值:A280/A260= 0.5
含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測(cè)定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。
蛋白質(zhì)濃度=1.45×A280 - 0.74×A260 (mg/mL)
215 nm與225 nm的吸收差法：
蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280 nm的光吸收測(cè)定時(shí)，可用215nm與225 nm吸收值之差，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。
用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成20~100 mg/mL的一系列5.0 mL的蛋白質(zhì)溶液，分別測(cè)定215 nm和225 nm的吸光度值，并計(jì)算出吸收差:
吸收差D= A215 - A225
以吸收差D為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測(cè)出未知樣品的吸收差，即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。
肽鍵測(cè)定法：
蛋白質(zhì)溶液在238 nm處的光吸收的強(qiáng)弱，與肽鍵的多少成正比。因此可以用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制一系列50~500 mg/mL已知濃度的5.0 mL蛋白質(zhì)溶液，測(cè)定238 nm的光吸收值A(chǔ)238，以A238為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的濃度即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。