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蛋白質(zhì)純化有哪些步驟呢?

來源:天津益元利康生物科技有限公司   2023年09月06日 16:54  

蛋白質(zhì)純化是利用基因工程技術(shù)將編碼蛋白質(zhì)的核酸序列導入宿主細胞,使其大量表達,然后采用合適的純化方法進行體外純化,以獲得高純度、高活性和高產(chǎn)量的蛋白質(zhì)的過程。那么你知道蛋白質(zhì)純化操作步驟?讓我們一起來看看吧!

1、構(gòu)建原核表達質(zhì)粒:目的基因PCR,載體酶切,連接,轉(zhuǎn)化,挑單克隆送測序;

2、將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21DE3)中,37℃培養(yǎng)過夜,挑單克隆小搖過夜;

3、小誘導摸索最佳誘導條件:將搖過夜的菌液1:1000接種到3mL LB中,37℃搖4-5h至菌液OD600=0.6-0.8,加入不同濃度IPTG0.1-1mM),不同溫度下誘導,隨著溫度降低,誘導時間延長,如37 ℃ 誘導4-5h,30°C誘導6h-8h,16°C誘導16-20h,取不同誘導條件下誘導前和誘導后的菌液,跑膠,考染,觀察誘導結(jié)果;(一般來說,IPTG濃度越低,誘導溫度越低,目的蛋白表達越慢,越利于蛋白質(zhì)的正確折疊從而增加其可溶性,減少包涵體的產(chǎn)生)

4、找到最適誘導條件后,將菌液1:1000接種到2LLB中,37℃搖至菌液OD600=0.6-0.8,吸出20μL菌液留待跑膠(1),然后在預(yù)實驗得到的合適的誘導條件下誘導蛋白表達,吸出20μL菌液留待跑膠(2);

5、取出誘導后的菌液,4000g,4℃離心15min

6、棄上清液,稱重,每克菌加入10mL Lysis buffer1:100加蛋白酶抑制劑),重懸,冰上放置約30min

7、壓力破碎:放掉高壓均質(zhì)儀中的酒精,用水沖兩遍,用Lysis buffer平衡一遍,加入菌液,加壓(壓力不要超過800kpa),菌液過三到五遍至透明不粘稠;

8、收集破碎后的菌液,12000g,4℃離心20min,將上清和沉淀分離,各留取20μL樣品(3)(4)待跑膠;

9、將2mL Ni-NTA加入純化柱,待乙醇濾過,用水沖洗,加入Lysis buffer平衡柱子;

10、用Lysis bufferNi-NTA重懸加入上清中,混勻,4℃搖床孵育2h;

11、將上清液4℃過柱,收集濾過液20μL(5);

12、用5mL Wash buffer洗柱子3次,收集濾過液樣品20μL(6);

13、加入1mL Elution buffer,孵育5min,收集洗脫液,重復5次,收集5mL洗脫液于同一管中,留取20μL樣品(7);

14、將實驗過程中得到的各個蛋白樣品跑膠,考馬斯亮藍染色1h,脫色至背景藍色較淺,可見清晰蛋白條帶;

15、分析各個樣品的蛋白條帶情況,根據(jù)結(jié)果進行后續(xù)操作:若洗脫蛋白樣品中蛋白無雜帶或雜帶少且淺,可進行透析與濃縮,若雜帶多則需要再次純化后進行透析與濃縮。

16、透析:將樣品加入透析膜中,兩端夾緊,4℃透析過夜;

17、濃縮:根據(jù)樣品分子量大小選擇合適的濃縮管4℃低速濃縮,濃縮后測蛋白濃度,分裝標記,在液氮中速凍,然后凍存于-80℃冰箱。

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