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干貨│從原理到應(yīng)用，帶你全方面了解T4 gene 32 protein

來(lái)源：翌圣生物科技（上海）股份有限公司 2023年09月12日 17:28

T4噬菌體基因32編碼蛋白(T4 gene 32 protein，gp32)是一種單鏈DNA（ssDNA）結(jié)合蛋白，為T4噬菌體DNA復(fù)制和修復(fù)所必需。它被廣泛地用于穩(wěn)定和標(biāo)記ssDNA區(qū)域，以便用電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)DNA的結(jié)構(gòu)、促進(jìn)限制性內(nèi)切酶的消化反應(yīng)、提高RT-PCR中反轉(zhuǎn)錄的效率、增強(qiáng)T4 DNA聚合酶的活性和提高PCR的產(chǎn)量等。

T4 gene 32 protein的結(jié)構(gòu)

T4 gene 32 protein由301個(gè)氨基酸組成，大小為34 kDa，包含三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：核心結(jié)構(gòu)域、N端結(jié)構(gòu)域（NTD）和C端結(jié)構(gòu)域（CTD）。

核心結(jié)構(gòu)域：包含ssDNA的結(jié)合位點(diǎn)，并具區(qū)分單鏈、雙鏈DNA的能力；
C端結(jié)構(gòu)域（CTD）：涉及異型蛋白相互作用，帶負(fù)電荷，調(diào)節(jié)gp32與復(fù)制、修復(fù)和重組機(jī)制中其他成分的相互作用；
N端結(jié)構(gòu)域（NTD）：負(fù)責(zé)同型蛋白相互作用，帶正電荷，與鄰近的gp32單體的核心結(jié)構(gòu)域之間通過(guò)蛋白-蛋白接觸，使gp32蛋白以頭-尾方向結(jié)合ssDNA。

圖1. gp32結(jié)構(gòu)域[1]

T4 gene 32 protein介導(dǎo)的DNA重組修復(fù)

DNA損傷時(shí)，后隨鏈合成岡崎片段，gp32與前導(dǎo)鏈結(jié)合

當(dāng)前導(dǎo)鏈聚合酶(紅色)在DNA損傷處（X）停滯時(shí)，前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成會(huì)解耦聯(lián)，后隨鏈的合成機(jī)制可以合成與受損部位重疊的岡崎片段(綠線)，同時(shí)會(huì)在停滯的前導(dǎo)鏈聚合酶前面打開(kāi)一個(gè)ssDNA缺口，該缺口被gp32覆蓋(橙色)；

模板子鏈3 '端解旋

gp32單體簇通過(guò)阻止Dda解旋酶加載到后隨鏈上來(lái)阻止其對(duì)復(fù)制叉移動(dòng)的刺激，并促進(jìn)模板子鏈3 '端的解旋；

模板轉(zhuǎn)換恢復(fù)復(fù)制叉移動(dòng)

UvsX重組酶和Dda解旋酶催化模板轉(zhuǎn)換來(lái)恢復(fù)停滯的復(fù)制叉；

跨損傷DNA合成

進(jìn)行后續(xù)無(wú)錯(cuò)誤的跨損傷DNA合成。

圖2. gp32介導(dǎo)的重組修復(fù)過(guò)程[2]

T4 gene 32 protein應(yīng)用

重組酶聚合酶擴(kuò)增

（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）

該技術(shù)可以在37~42 ℃條件下實(shí)現(xiàn)待測(cè)靶標(biāo)的快速檢測(cè)，具有反應(yīng)靈敏度高、特異性強(qiáng)、對(duì)儀器依賴程度低且可整合多種檢測(cè)模式等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基層和現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

圖3. 重組酶聚合酶擴(kuò)增RPA技術(shù)擴(kuò)增原理圖[3]

RPA具體流程如下：

重組酶引物復(fù)合體的形成

重組酶T4 UvsX在ATP的參與和定位因子（T4 UvsY）的幫助下與擴(kuò)增引物結(jié)合形成重組酶引物復(fù)合體，并在雙鏈DNA中尋找同源序列；

重組酶引物復(fù)合體定位至同源序列

重組酶引物復(fù)合體一旦定位到同源序列，則會(huì)插入雙鏈DNA形成D-環(huán)結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)鏈置換反應(yīng)，單鏈結(jié)合蛋白gp32會(huì)與解開(kāi)的DNA鏈結(jié)合防止進(jìn)一步被置換；

鏈置換擴(kuò)增啟動(dòng)

重組酶T4 UvsX從重組酶引物復(fù)合體中被水解，3'端引物暴露并與Bsu DNA聚合酶結(jié)合，DNA開(kāi)始復(fù)制延伸，最終兩條母鏈分離，形成兩條新的互補(bǔ)雙鏈DNA。該反應(yīng)在37-42℃下進(jìn)行，可在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列1012倍的擴(kuò)增。

核酸依賴性擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA）

該技術(shù)由一對(duì)引物介導(dǎo)，反應(yīng)在42℃進(jìn)行，可在2 h左右將模板RNA擴(kuò)增約109～1012倍，不需特殊的儀器，具有較高的特異性和靈敏度。廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、霉菌、寄生蟲(chóng)和細(xì)胞因子等的檢測(cè)，特別是用于艾滋病病毒、丙肝肝炎病毒等RNA病毒的檢測(cè)當(dāng)中。在動(dòng)物疫病預(yù)防控制方面，NASBA方法已成為診斷病毒的國(guó)家診斷標(biāo)準(zhǔn)方法之一（GB/T19440-2004 病毒NASBA 檢測(cè)方法）。

圖4. NASBA工作流程圖[4]

在NASBA中加入gp32，可以穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄形成的單鏈cDNA，減少NASBA中對(duì)熱退火步驟的依賴，提高NASBA程序的簡(jiǎn)單性。

其他應(yīng)用

1）PCR擴(kuò)增中，使用gp32可以顯著地提高片段的擴(kuò)增長(zhǎng)度及產(chǎn)量[5]，并減輕血紅素、腐殖酸等抑制物的對(duì)PCR擴(kuò)增的抑制作用[6]。如圖5所示，將濃度的抑制劑加入含有5 pg模板DNA的反應(yīng)混合物中，另外在不添加抑制劑的情況下，檢測(cè)0.05、0.5和5 pg模板DNA的擴(kuò)增情況。結(jié)果顯示在PCR體系種添加gp32可顯著減輕抑制劑對(duì)PCR擴(kuò)增的抑制。

圖5. T4 gene 32 protein解除抑制劑對(duì)PCR的干擾[6]。A：不含gp32的標(biāo)準(zhǔn)PCR條件；B：含有150 ng/mL gp32的PCR條件

2）Gp32通過(guò)阻止模板ssDNA和RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，分別增強(qiáng)T7 RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，從而增加體外轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)量[7]。

翌圣T4 gene 32 protein

翌圣的T4 gene 32 protein由ZymeEditor酶改造平臺(tái)重組表達(dá)而來(lái)，蛋白純度高，核酸酶殘留水平低，批次間穩(wěn)定性優(yōu)異，宿主DNA殘留水平極低，適用于RPA、NASBA技術(shù)、PCR、NGS文庫(kù)構(gòu)建等應(yīng)用。

客戶測(cè)試案例展示

圖5.客戶測(cè)試翌圣重組酶聚合酶核心酶原料擴(kuò)增結(jié)果圖
注：2、4為陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組；1、3為陰性對(duì)照組

客戶采用翌圣Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL)、T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL)、T4 UvsY protein (2 μg/μL)、T4 gene 32 protein (gp 32)、肌酸激酶Creatine Kinase (2 μg/μL) 進(jìn)行RPA擴(kuò)增反應(yīng)，得到正確的目的條帶，且條帶清晰、明亮，結(jié)果表明，翌圣重組酶聚合酶擴(kuò)增核心酶原料可實(shí)現(xiàn)高效RPA等溫?cái)U(kuò)增。

RPA產(chǎn)品推薦

產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號(hào)	產(chǎn)品作用
Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL)	11078ES	結(jié)合引物與原始靶核酸序列互補(bǔ)合成新的DNA模板
T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL)	11079ES	具有配對(duì)和鏈轉(zhuǎn)移活性的重組酶
T4 UvsY protein (2 μg/μL)	11080ES	重組酶輔助因子，刺激T4 UvsX的單鏈DNA依賴性ATP酶活性并降低活性所需的T4 UvsX臨界濃度
T4 gene 32 protein (gp 32) T4噬菌體基因32編碼蛋白	11081ES	參與DNA復(fù)制、修復(fù)、重組與解鏈后的單鏈DNA結(jié)合，防止自雜交
Creatine Kinase (2 μg/μL) 肌酸激酶	14502ES	刺激ATP和肌酸分解為磷酸肌酸和ADP，釋放能量
Exonuclease III (100 U/μL)	14525ES	具有3’→5’外切酶活性，切斷熒光探針中淬滅基團(tuán)，釋放熒光

參考文獻(xiàn)

[1] Cashen BA, Morse M, Rouzina I, Karpel RL, Williams MC. Dynamic structure of T4 gene 32 protein filaments facilitates rapid noncooperative protein dissociation [published online ahead of print, 2023 Jul 14]. Nucleic Acids Res. 2023;gkad595.

[2] Jordan CS, Morrical SW. Regulation of the bacteriophage T4 Dda helicase by Gp32 single-stranded DNA-binding protein. DNA Repair (Amst). 2015;25:41-53.

[3] 王亞楠, 陳昌國(guó). 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)雜志, 2021, 46(5):8.

[4] Nai YH, Doeven EH, Guijt RM. An improved nucleic acid sequence-based amplification method mediated by T4 gene 32 protein. PLoS One. 2022;17(3):e0265391. Published 2022 Mar 24.

[5] Schwarz K, Hansen-Hagge T, Bartram C. Improved yields of long PCR products using gene 32 protein. Nucleic Acids Res. 1990;18(4):1079.

[6] Kreader CA. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl Environ Microbiol. 1996;62(3):1102-1106.

[7] Piché C, Schernthaner JP. Optimization of in vitro transcription and full-length cDNA synthesis using the T4 bacteriophage gene 32 protein. J Biomol Tech. 2005;16(3):239-247.

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