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感覺(jué)神經(jīng)元的高對(duì)比度快速三維成像
深入了解此類(lèi)神經(jīng)元在觸覺(jué)和痛覺(jué)中的作用
本文討論了相比傳統(tǒng)的寬場(chǎng)顯微鏡，使用large volume computational clearing（LVCC）技術(shù)的THUNDER組織成像系統(tǒng)如何獲取背根神經(jīng)節(jié)（DRG）組織高對(duì)比度的快速三維成像圖，獲得感覺(jué)神經(jīng)元更為清晰的解析圖像。神經(jīng)科學(xué)研究的一項(xiàng)主要領(lǐng)域集中在感覺(jué)神經(jīng)元對(duì)觸覺(jué)和痛覺(jué)的影響方面。深入理解這種現(xiàn)象對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病和療法的發(fā)展具有重要意義。
簡(jiǎn)
介
確定感覺(jué)神經(jīng)元的多樣性及其在觸覺(jué)和痛覺(jué)中的作用，對(duì)于診斷和治療周?chē)∽儯粗車(chē)窠?jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)疾病）非常重要[1,2]。了解感覺(jué)缺陷、慢性疼痛和感覺(jué)神經(jīng)元病理變化之間的聯(lián)系，有助于開(kāi)發(fā)新的疼痛療法，以改善神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。此報(bào)告結(jié)果表明，使用THUNDER成像技術(shù)對(duì)感覺(jué)神經(jīng)元進(jìn)行高對(duì)比度的快速三維成像可以幫助研究人員深入了解病變。
挑
戰(zhàn)
一種能夠快速獲取厚神經(jīng)節(jié)組織的高對(duì)比度成像，使重要的標(biāo)本細(xì)節(jié)得到清晰解析的成像方法，對(duì)于病變研究非常重要。傳統(tǒng)的寬場(chǎng)顯微鏡具有出色的速度和檢測(cè)靈敏度，但由于存在厚組織的離焦平面信號(hào)，此類(lèi)圖像通常會(huì)存在離焦模糊或霧面現(xiàn)象。這些因素會(huì)顯著降低圖像對(duì)比度[3,4]。
方
法
背跟神經(jīng)節(jié)（DRG）的組織標(biāo)本來(lái)自感覺(jué)神經(jīng)元亞群表達(dá)tdTomato（紅色）的轉(zhuǎn)基因小鼠。采用多聚甲醛固定的20μm的冷凍切片用抗mCherry一級(jí)抗體過(guò)夜孵育，然后用Cy3偶聯(lián)的二級(jí)抗體染色，并用Fluoromount G封片。背景神經(jīng)元自發(fā)熒光可以通過(guò)GFP濾光片組檢測(cè)，以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元計(jì)數(shù)（綠色）。使用THUNDER組織成像系統(tǒng)和large volume computational clearing（LVCC）技術(shù)獲取三維z堆棧圖像[3,4]。然后用LAS X擴(kuò)展景深處理工具創(chuàng)建二維投影圖。
結(jié)
果
使用THUNDER成像技術(shù)采集的神經(jīng)節(jié)組織標(biāo)本圖像如下圖1所示。
圖1：小鼠背根神經(jīng)節(jié)中某些感覺(jué)神經(jīng)元中表達(dá)tdTomato（紅色）的原始寬場(chǎng)圖像（A）和THUNDER成像圖像（B）。圖片來(lái)自美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校，病理生物學(xué)系獸醫(yī)學(xué)院LaTasha K. Crawford博士。
結(jié) 論
THUNDER組織成像系統(tǒng)和large volume computational clearing（LVCC）可以通過(guò)消除離焦模糊讓小鼠組織的寬場(chǎng)熒光圖像變清晰，從而揭示背根神經(jīng)節(jié)的精細(xì)結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。
參考文獻(xiàn)：
1.L.K. Crawford, M.J. Caterina, Functional Anatomy of the Sensory Nervous System: Updates From the Neuroscience Bench, Toxicologic Pathology (2020) vol. 48, iss. 1, pp. 174-189, DOI: 10.1177/0192623319869011.
2.E.L. Tran, L.K. Crawford, Revisiting PNS Plasticity: How Uninjured Sensory Afferents Promote Neuropathic Pain, Front. Cell. Neurosci. (2020) vol. 14, DOI: 10.3389/fncel.2020.612982.
3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.
4.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.
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