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漲知識 | qPCR專場七：認識不同熒光定量PCR方法
熒光定量PCR實驗因為靈敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實驗過程中，我們需要注意諸多細節(jié)，謹慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實驗，拿到實驗結(jié)果，發(fā)表高分文章，走上人生呢？
圖.PCR循環(huán)流程
染料法熒光定量PCR | 探針法熒光定量PCR | |
特異性 | 中 | 高 |
靈敏度 | 中 | 高 |
可重復性 | 中 | 高 |
多重反應 | - | 可多重 |
探針/引物設計 | 引物 | 探針+引物 |
實驗成本 | 低 | 高 |
應用 | 特定基因表達差異分析；DNA定量 | 特定基因表達分析；DNA定量；SNPs基因分析；基因突變檢測；產(chǎn)前遺傳病檢測；傳染病早期病原體檢測 |
另外不同miRNA之間堿基序列的差異不大，在僅有的18-28個核苷酸內(nèi)，不同miRNA甚至會出現(xiàn)僅1個核苷酸不同的現(xiàn)象，高效特異性區(qū)分不同miRNA也十分重要。因此，常規(guī)的熒光定量可能難以滿足miRNA實驗目標所需，需要選用專門針對短片段擴增，且能高特異性準確定量的熒光定量試劑。
多重熒光檢測，可以通過單個PCR反應中進行多個基因的擴增從而減少qPCR反應所需要的樣品量，且該方式和單重熒光定量檢測一樣靈敏準確。除了節(jié)省樣本量外，還可節(jié)省試劑以及設置實驗程序和分析實驗結(jié)果所需要的時間。單孔擴增多個基因也可最大限度地減少移液誤差。
使用多重熒光定量PCR也有需要注意的事項，其中最為重要的是，需要保證不同基因在單重熒光定量反應中和多重熒光定量反應中的結(jié)果是一致的。尤其是擴增的基因中同時存在著低豐度表達基因和高豐度表達基因。
cDNA量充足：反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA可選擇通過稀釋或者直接使用的方式滿足多次實時熒光定量實驗；
滿足多靶標：通過oligo dT和隨機引物，可以從單個RNA樣本中擴增多個靶標。
便捷性差：兩步反應需要更多的處理，不太適合高通量應用；
污染風險：由于每個步驟都需要使用單獨的管子，污染的風險增加；
cDNA產(chǎn)物中殘留試劑的抑制：反轉(zhuǎn)錄酶和反轉(zhuǎn)錄緩沖液殘留會一定程度抑制熒光定量PCR，因此在熒光定量PCR中建議僅使用10%的cDNA進行反應。若稀釋不當，相關殘留組分可能會抑制DNA聚合酶。
減少污染：一管一步式可防止在反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR階段之間引入污染物；
便捷：移液步驟減少，手動操作時間減少；
高通量檢測：每個樣本獲得結(jié)果的總時間縮短且可重現(xiàn)性高；
靈敏度高：所有產(chǎn)生的第一鏈cDNA都可用于實時PCR擴增，一定程度上提高靈敏度。
二聚體風險增加：上下游基因特異性引物在42℃-50℃下更易發(fā)生二聚體聚合，從而導致非特異擴增；
檢測靶標數(shù)少：單一RNA模板能夠檢測的靶標數(shù)量相對較少。
方法 | 分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 |
RNA提取 | 同Trizol提取 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent | 10606ES |
動物組織/細胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快15 min完成 | MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細胞/組織總RNA提取試劑盒 | 19221ES | |
簡單植物總RNA提取，避開有毒試劑，最快40min完成 | MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒 | 19291ES | |
多糖多酚植物總RNA提取，最快30min完成 | MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒 | 19292ES | |
細胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快8 min完成 | MolPure® Cell RNA Kit 培養(yǎng)細胞RNA提取試劑盒 | 19231ES | |
qPCR染料法 | 高靈敏通用型定量預混液(染料法) | Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | 11184ES |
定量預混液 (染料法)，已發(fā)文章累計IF達到5000+ | Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11201ES | |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11202ES | ||
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11203ES | ||
高靈敏型qPCR預混液（染料法） | Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11198ES | |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11199ES | ||
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11200ES | ||
miRNA加A法高特異性定量預混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（加A法） | 11171ES | |
miRNA莖環(huán)法高特異性定量預混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（莖環(huán)法） | 11170ES | |
高靈敏一步法反轉(zhuǎn)定量試劑盒(染料法) | Hifair® III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit | 11143ES | |
細胞直擴RT-qPCR，1.5 h從細胞到基因表達分析(染料法) | Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit | 11172ES | |
反轉(zhuǎn)錄試劑 | 5 min快速反轉(zhuǎn)，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)-示蹤版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11149ES |
5 min快速反轉(zhuǎn)，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR)-常規(guī)版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye） | 11150ES | |
15 min一步完成gDNA去除與反轉(zhuǎn)錄(下游應用qPCR) | Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR | 11142ES | |
鏈cDNA合成預混液，含gDNA去除(下游應用qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES | |
最長可滿足19.8 kb cDNA合成試劑盒，含gDNA去除(下游應用PCR/qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) | 11139ES | |
常規(guī)30 min反轉(zhuǎn)預混液,含gDNA去除（下游應用qPCR） | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11123ES | |
miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（加A法） | Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法） | 11148ES |
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