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漲知識 | 克隆專題二：不同分子克隆方法介紹（下）

來源：翌圣生物科技（上海）股份有限公司 2023年10月20日 17:39

漲知識 | 克隆專題二：不同分子克隆方法介紹（下）

克隆是英文“clone”或“cloning”的音譯，而英文“clone”則起源于希臘文“Klone”，原意是指以幼苗或嫩枝插條。1963年J.B.S.Haldane在題為“人類種族在未來二萬年的生物可能性”的演講上采用“克?。–lone）”的術(shù)語，把“克隆技術(shù)”帶到了人們的視野中。

克隆技術(shù)又稱為“生物放大技術(shù)”，目前應(yīng)用泛的技術(shù)為“分子克隆”，又稱重組DNA技術(shù)，即通過重組技術(shù)將目的DNA片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。

之前小翌給小伙伴們介紹了常規(guī)的分子克隆方法，接下來繼續(xù)帶領(lǐng)大家認(rèn)識一下新的、非常規(guī)的分子克隆技術(shù)，包括無縫克隆中的Golden Gate技術(shù)、Gateway技術(shù)、不依賴基因序列和連接反應(yīng)的克隆方法等等。

Golden Gate技術(shù)

Golden Gate克隆在2008年由Engler等人提出，是依賴IIS型限制酶的無縫克隆技術(shù)，能媲美Gibson Assembly，主要用于多片段克隆組裝。實(shí)驗(yàn)步驟與傳統(tǒng)克隆技術(shù)相似，但限制性內(nèi)切酶酶切原理不同。傳統(tǒng)酶切使用的TypeII型限制性內(nèi)切酶通常識別4-8 bp的回文序列，并在識別序列內(nèi)部切割產(chǎn)生粘性末端或平末端。

Golden Gate克隆技術(shù)通過TypeIIS型限制性內(nèi)切酶（翌圣BsmBI Cat#15203ES、BspQI限制性內(nèi)切酶Cat#15202ES、FuniCut™ BsaI Cat#15005ES）識別目的序列以外的四個(gè)堿基，剪切后獲得粘性末端，直接用于目的片段的連接。通過連接酶（翌圣T4 DNA連接酶Cat#10300）連接形成重組質(zhì)粒，使用轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，由于限制性內(nèi)切酶的特性，酶切連接后酶切位點(diǎn)不再存在，能達(dá)到精確的無縫克隆。Engler等人利用該技術(shù)成功連接了9個(gè)目的片段，連接率達(dá)90%以上。

圖1. Golden Gate Assembly克隆原理示意圖【1】

Gateway技術(shù)

Gateway技術(shù)最早在1990s年被發(fā)現(xiàn)應(yīng)用，主要用于表達(dá)載體、RNAi干擾載體等載體的構(gòu)建。其原理利用噬菌體的特性：即噬菌體DNA會(huì)定點(diǎn)整合到細(xì)菌宿主基因組上?？茖W(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體和細(xì)菌內(nèi)均含有重組位點(diǎn)attP和attB，能有效幫助噬菌體入侵宿主細(xì)胞，從而將噬菌體DNA插入到細(xì)菌基因組上，同時(shí)在重組位點(diǎn)上產(chǎn)生兩個(gè)新位點(diǎn)：attL和attR，該過程可逆。

Gateway構(gòu)建表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)流程如下圖：

圖2. Gateway技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體【2】

此技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于利用位點(diǎn)特異重組成入門載體后，不再受到酶切位點(diǎn)和連接酶的限制，可以多次轉(zhuǎn)移到其他載體上。再加上供體載體含有ccdB致死基因，會(huì)殺死重組不成功的質(zhì)粒，所以陽性克隆率高，但受控于存在的介導(dǎo)蛋白和重組位點(diǎn)。此外，需要注意的一點(diǎn)是，進(jìn)行重組反應(yīng)時(shí)需要使用對CcdB敏感的大腸桿菌菌株，如翌圣DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（Cat#11802ES）、翌圣化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（Cat#11801ES），能抑制大腸桿菌菌株的生長繁殖，進(jìn)行負(fù)篩。

不依賴基因序列和連接反應(yīng)的克隆方法（SLIC）

2007年，來自于哈佛醫(yī)學(xué)院的Li等人建立了不依賴序列和連接的克隆方法（Sequence and ligation-independent cloning，SLIC）。SLIC方法不受目的序列和連接反應(yīng)的限制，能將任意、多個(gè)DNA片段組裝起來，在體外完成重組反應(yīng)，用途非常廣泛。

基本操作流程如下：

PCR擴(kuò)增目的片段，在片段兩端分別加上15-30 bp的同源序列；

利用T4 DNA聚合酶的3'-5'外切酶活性，在22℃條件下消化DNA片段，產(chǎn)生含有同源序列的5'-ssDNA突出端。突出端長度可通過dCTP控制；

將處理后的目的片段置于T4 DNA連接緩沖液中，于37℃完成突出單鏈的復(fù)性重組，形成含有缺口的環(huán)狀中間體，直接轉(zhuǎn)化細(xì)胞；

利用大腸桿菌自身的修復(fù)系統(tǒng)使其形成完整的環(huán)狀質(zhì)粒。

圖3. SLIC法構(gòu)建表達(dá)載體的步驟【3】

細(xì)胞裂解物體外無痕連接

細(xì)胞裂解物體外無痕連接（SLiCE）是利用細(xì)胞裂解物而進(jìn)行體外無痕組裝DNA的方法，能一步組裝多個(gè)目的片段。它在2012年由Zhang等人提出，在2013年由Fisher等人進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，擴(kuò)增了可用于該技術(shù)的細(xì)胞裂解物，此外，Itaya等人發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌本身就具有可用于片段組裝的同源重組系統(tǒng)，進(jìn)一步擴(kuò)展了可用的細(xì)胞裂解物來源。相比于其他不依賴限制性內(nèi)切酶和連接酶的技術(shù)，SLiCE方法使用的細(xì)胞裂解物更易獲得和保存，實(shí)驗(yàn)成本更低，適用于大多數(shù)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室。

其具體的操作步驟是，利用PCR技術(shù)在目的片段兩側(cè)分別加上20-25 bp的同源序列，用DpnI酶（翌圣FuniCut™ DpnI Cat#15052ES）消化處理，組裝片段按合適的比例混勻，加入大腸桿菌細(xì)胞裂解物，37℃反應(yīng)1 h，然后直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，即可實(shí)現(xiàn)體外無痕組裝DNA。

圖4. SLiCE技術(shù)【4】

通過上述兩篇專題，小翌介紹了一些傳統(tǒng)的、應(yīng)用范圍廣的、新型的分子克隆方法，希望對各位科研er們的日常實(shí)驗(yàn)有所幫助和啟發(fā)。隨著近幾年基因編輯技術(shù)、合成生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，分子克隆技術(shù)越來越趨于高效化、多樣化，其中的每一項(xiàng)內(nèi)容都值得我們?nèi)ヌ骄俊ｊP(guān)注我們，小翌會(huì)在下一期的分子克隆技術(shù)專題中給大家具體講解分子克隆技術(shù)中應(yīng)用到那些技術(shù)，為您的實(shí)驗(yàn)帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~

相關(guān)產(chǎn)品列表

產(chǎn)品定位	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號	規(guī)格
Golden Gate組裝	BspQI限制性內(nèi)切酶 (10 U/μL)	15202ES76	500 U
Golden Gate組裝	BsmBI（10 U/μL）	15203ES80	1000 U
通用緩沖液，5min完成精準(zhǔn)酶切	FuniCut™快速限制性內(nèi)切酶	15001ES-15051ES	50 T
T4連接	Hieff® Gold T4 DNA Ligase	10300ES80	1000 U
5 min快速完成感受態(tài)轉(zhuǎn)化	F DH5α化學(xué)感受態(tài)	11803ES80	10×100 μL
常規(guī)化學(xué)感受態(tài)	DH5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	11802ES80	10×100 μL
常規(guī)化學(xué)感受態(tài)	化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	11801ES80	10×100 μL
常規(guī)PCR	2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye)	10102ES03/08	1 mL/5×1 mL
常規(guī)PCR，不含染料	2×Hieff® PCR Master Mix(No Dye)	10103ES03/08	1 mL/5×1 mL
快速PCR，快至1s/kb	2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye)	10157ES03/08	1 mL/5×1 mL

參考文獻(xiàn)

1.Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, et al. Golden Gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIS restriction enzymes. PLoS ONE, 2009, 4(5): E5553.
2.林春晶, 韋正乙, 蔡勤安等. 幾種植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法[J].生物技術(shù), 2008(05): 84-87.
3.張陽璞, 楊淑慎. 幾種新型植物基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法[J].生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(03): 311-327.
4.楊發(fā)譽(yù), 楊云彭, 霍毅欣. 合成生物學(xué)中不依賴限制性內(nèi)切酶的分子克隆策略[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2018, 34(04): 364-370.

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