椎間盤(pán)退行性變（IDD）是一個(gè)慢性炎性狀態(tài)，其特征是椎間盤(pán)（IVD）內(nèi)的髓核（NP）活細(xì)胞喪失和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）破壞。目前，如何提高NP細(xì)胞活力，降低死亡率成為IDD治療發(fā)展的緊迫問(wèn)題。

溶酶體是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要降解細(xì)胞器。針對(duì)溶酶體損傷，溶酶體自噬作為重要的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，在防止不可逆細(xì)胞損傷方面發(fā)揮作用。溶酶體自噬是指通過(guò)選擇性自噬對(duì)受損溶酶體有效清除的過(guò)程。溶酶體活性維持正確的細(xì)胞功能，其失調(diào)與多種疾病有關(guān)，包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病或與衰老相關(guān)的疾病。溶酶體損傷參與多種形式的細(xì)胞死亡過(guò)程，如細(xì)胞凋亡、壞死、焦亡及鐵死亡等。鐵死亡是指鐵依賴(lài)性脂質(zhì)過(guò)氧化和活性氧（ROS）誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡。溶酶體通過(guò)改變鐵攝取和鐵排出的水平來(lái)調(diào)控鐵死亡。當(dāng)涉及到受損的溶酶體和溶酶體自噬活性時(shí)，調(diào)節(jié)機(jī)制仍然未知。先前的研究表明NP細(xì)胞中存在鐵死亡，并初步探討了其在IDD中的作用。然而，鐵死亡相關(guān)椎間盤(pán)退變的潛在機(jī)制很復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究。

Ras-GTP酶激活蛋白SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白1（G3BP1）是眾suo周知的應(yīng)激顆粒成分，在調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老、免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮作用。最近的研究表明，G3BP1可以調(diào)節(jié)雷帕霉素（mTOR）信號(hào)通路機(jī)制靶點(diǎn)的激活，起到溶酶體系鏈的作用。這些發(fā)現(xiàn)支持G3BP1可以影響溶酶體的功能，可能包括溶酶體的數(shù)量和活性。因此，有理由懷疑G3BP1在應(yīng)力條件下調(diào)節(jié)溶酶體自噬活性和溶酶體修復(fù)。此外，在IDD進(jìn)展過(guò)程中，G3BP1與mTOR信號(hào)通路之間的關(guān)系仍需在NP細(xì)胞中驗(yàn)證。

最近，在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，推測(cè)G3BP1通過(guò)在IDD過(guò)程中調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵死亡介導(dǎo)溶酶體自噬和溶酶體活性，并進(jìn)一步研究了G3BP1和mTOR信號(hào)在體內(nèi)椎間盤(pán)退變模型中的作用。該研究加深了對(duì)NP細(xì)胞G3BP1、溶酶體自噬和鐵死亡之間關(guān)系的認(rèn)識(shí)，為IDD治療提供了新的靶點(diǎn)。

首先，實(shí)驗(yàn)測(cè)量了G3BP1和Galectin-3（溶酶體損傷的標(biāo)志物）在人NP組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在退變NP組織中G3BP1表達(dá)水平低，Galectin-3表達(dá)水平高，而且G3BP1和Galectin-3 水平均與NP組織的退行性分級(jí)相關(guān)。這表明，在IDD的進(jìn)展過(guò)程中，G3BP1的水平逐漸降低，溶酶體損傷增加。

壓縮力是IDD的常見(jiàn)致病因素。因此實(shí)驗(yàn)利用體外靜態(tài)壓縮力裝置（1.0 MPa）來(lái)模擬NP細(xì)胞周?chē)耐獠凯h(huán)境。LLOMe（L-亮氨酸甲酯的二肽縮合物）能夠在溶酶體中積累，并用于誘導(dǎo)溶酶體損傷。結(jié)果觀察到，Galectin-3的蛋白質(zhì)水平在壓縮組和LLOMe組中均增加（圖1 A），而且壓縮力處理誘導(dǎo)Galectin-3陽(yáng)性溶酶體在NP細(xì)胞中的積累（圖1 B）。它揭示了NP細(xì)胞在壓縮壓力下溶酶體損傷的增加。另一方面，發(fā)現(xiàn)壓縮處理增加了NP細(xì)胞的死亡率（圖1 C）。

為了進(jìn)一步研究是否發(fā)生鐵死亡，將NP細(xì)胞與DCFH-DA探針一起孵育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在加壓處理后，細(xì)胞ROS水平升高（圖1 D），GPX4和FTL的蛋白質(zhì)水平均降低（一些蛋白質(zhì)，如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）和鐵蛋白輕鏈（FTL）參與調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵死亡）（圖1 E）。結(jié)果表明，在壓縮壓力下溶酶體損傷伴有細(xì)胞鐵死亡。同時(shí)，加壓組細(xì)胞游離鐵濃度升高（圖1 F）。游離鐵可能從嚴(yán)重受損的溶酶體中釋放出來(lái)。脂質(zhì)ROS水平表示脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，這是鐵死亡的標(biāo)志。結(jié)果表明，壓縮和LLOMe處理均誘導(dǎo)脂質(zhì)ROS水平升高（圖1 G、H）。這些結(jié)果表明，壓縮處理誘導(dǎo)溶酶體損傷，進(jìn)而加重NP細(xì)胞的鐵死亡。

圖1   加壓處理誘導(dǎo)溶酶體損傷和NP細(xì)胞鐵死亡。

Trim16 是一種 E3 泛素連接酶，在溶酶體自噬起始中發(fā)揮作用，并募集接頭蛋白 VCP/p97來(lái)誘導(dǎo)溶酶體自噬。接下來(lái)，實(shí)驗(yàn)觀察到Trim16和p97的水平在加壓期間發(fā)生了變化。長(zhǎng)時(shí)間的壓力處理似乎損害了溶酶活性以及G3BP1的水平。為了進(jìn)一步揭示G3BP1在溶酶體自噬中的作用，siRNAs被用來(lái)敲低G3BP1的表達(dá)。結(jié)果表明，G3BP1敲低降低了Trim16的表達(dá)并誘導(dǎo)了p97的積累。同時(shí)，溶酶體自噬活性降低與ROS水平升高有關(guān)。G3BP1敲低組的細(xì)胞游離鐵和脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高。這表明G3BP1功能障礙加重細(xì)胞鐵死亡。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)G3BP1功能障礙誘導(dǎo)Galectin-3的積累和溶酶體損傷，這對(duì)于在壓縮壓力下加劇鐵死亡至關(guān)重要。

G3BP1被認(rèn)為是組裝應(yīng)激顆粒（SGs）的中心開(kāi)關(guān)。因此打算確定G3BP1是否參與壓縮壓力下的SG的形成。亞砷suan鹽可誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒組裝。結(jié)果表明，壓縮組G3BP1相關(guān)SG的形成不如亞砷suan鹽組明顯。這表明，G3BP1更可能作為溶酶體活性的調(diào)節(jié)劑，同時(shí)在壓縮壓力下也可能充當(dāng)SG成分。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)蛋白（mTOR）信號(hào)控制溶酶體代謝途徑。因此懷疑G3BP1通過(guò)mTOR信號(hào)調(diào)節(jié)溶酶體活性。結(jié)果表明，在壓縮壓力下磷酸化的mTOR水平降低，表明mTOR信號(hào)受到抑制（圖2 A）。NP細(xì)胞用mTOR信號(hào)激活劑MHY1485或特異性mTOR抑制劑雷帕霉素處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶酶體自噬活性同時(shí)被mTOR激活劑抑制，并被mTOR抑制劑激活（圖2 B）。此外，MHY1485處理還誘導(dǎo)NP細(xì)胞中ROS水平升高（圖2 C）。mTOR激活組細(xì)胞游離鐵濃度和脂質(zhì)ROS水平升高，在mTOR抑制組降低（圖2 D-F）。細(xì)胞死亡率在MHY1485組顯著升高，在雷帕霉素組降低（圖2 G）。這表明，mTOR信號(hào)傳導(dǎo)的激活加重了細(xì)胞鐵死亡，這與G3BP1敲低的效果相似。此外，MHY1485處理促進(jìn)溶酶體損傷，而雷帕霉素改善了溶酶體損傷（圖2 H、I）。這些結(jié)果表明，G3BP1通過(guò)mTOR信號(hào)調(diào)節(jié)溶酶體自噬和細(xì)胞鐵死亡。

然后，為了進(jìn)一步研究G3BP1在mTOR信號(hào)中的作用，研究人員打算揭示G3BP1與mTOR復(fù)合體的結(jié)合。實(shí)驗(yàn)觀察G3BP1與mTOR亞基TSC2的結(jié)合。TSC2的敲低誘導(dǎo)磷酸化mTOR水平升高，顯著抑制溶酶體自噬的活化，降低鐵死亡相關(guān)保護(hù)蛋白的水平，還誘導(dǎo)Galectin-3表達(dá)升高，表明溶酶體損傷加重。這些結(jié)果表明，G3BP1/TSC2 復(fù)合體使 mTOR 信號(hào)失活，以調(diào)節(jié)溶酶體自噬和NP細(xì)胞的鐵死亡。

圖2   G3BP1通過(guò)mTOR信號(hào)調(diào)節(jié)溶酶體自噬和鐵死亡結(jié)果。

最后，為了評(píng)估G3BP1對(duì)IDD的影響，建立了椎間盤(pán)退變模型，將靶向G3BP1的siRNAs注射到大鼠椎間盤(pán)中，并評(píng)估椎間盤(pán)的退變程度。結(jié)果表明，G3BP1的敲低促進(jìn)了IDD在體內(nèi)的進(jìn)展。

為了進(jìn)一步了解IDD進(jìn)展過(guò)程中的G3BP1/mTOR信號(hào)，在椎間盤(pán)退變模型中使用了靶向mTOR信號(hào)的藥物。結(jié)果表明，MHY1485提高了椎間盤(pán)的MRI分級(jí)，與IDD組相同（圖3 A、B）。MHY1485組椎間盤(pán)高度較對(duì)照組顯著降低（圖3 C、D）。然而，雷帕霉素可以部分改善IDD進(jìn)展過(guò)程中水分含量和椎間盤(pán)高度的損失。與IDD組相比，雷帕霉素組MRI分級(jí)較低，椎間盤(pán)高度指數(shù)（DHI）較高。此外，MHY1485組和IDD組NP區(qū)被纖維組織取代（圖3 E）。與MHY1485和IDD組相比，雷帕霉素組的退變分級(jí)較低，表明椎間盤(pán)的退變特征不太明顯（圖3 F）。這些結(jié)果表明，mTOR 信號(hào)失活會(huì)延緩體內(nèi) IDD 的進(jìn)展，G3BP1/mTOR信號(hào)參與體內(nèi)IDD的進(jìn)展，可能為IDD治療提供潛在的靶點(diǎn)。

圖3   mTOR信號(hào)傳的調(diào)控影響體內(nèi)IDD的進(jìn)展。

圖4   揭示G3BP1在壓縮誘導(dǎo)的溶酶體損傷和細(xì)胞鐵死亡中的保護(hù)作用的示意圖模型。

G3BP1 協(xié)調(diào) TSC/mTOR 復(fù)合體以啟動(dòng)溶酶體自噬以去除損傷的溶酶體。在壓縮壓力下，G3BP1功能障礙促進(jìn)溶酶體自噬的失活。受損溶酶體的積累誘導(dǎo)游離鐵和脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高，導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡。

總之，該研究調(diào)查了溶酶體自噬、溶酶體損傷和細(xì)胞鐵死亡之間的關(guān)系。G3BP1作為核心鏈接協(xié)調(diào)溶酶體自噬活性以清除損傷的溶酶體，從而抑制細(xì)胞游離鐵的過(guò)載。在壓縮壓力下，G3BP1似乎主要存在于溶酶體中，通過(guò)TSC2 / mTOR信號(hào)調(diào)節(jié)溶酶體功能，而不是形成應(yīng)激顆粒。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明了G3BP1和mTOR信號(hào)在NP細(xì)胞鐵死亡中的作用，并可能為IDD提供潛在的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Li S, Liao Z, Yin H, Liu O, Hua W, Wu X, Zhang Y, Gao Y, Yang C. G3BP1 coordinates lysophagy activity to protect against compression-induced cell ferroptosis during intervertebral disc degeneration. Cell Prolif. 2023 Mar;56(3):e13368. doi: 10.1111/cpr.13368. Epub 2022 Nov 30. PMID: 36450665; PMCID: PMC9977669.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36450665/

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