鈣化性主動脈瓣疾?。–AVD）已成為世界范圍內(nèi)是最常見的瓣膜性心臟病之一。在過去的幾十年中，一系列臨床、體內(nèi)和體外研究都指出炎癥是CAVD早期的主要機制。在瓣膜內(nèi)皮細胞（VEC）中，已知TNF-α可誘導(dǎo)炎癥和氧化應(yīng)激以及內(nèi)皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，IL-6也促進了這一過程。免疫細胞因子I型和II型干擾素（IFNs）已被證明可促進瓣膜間質(zhì)細胞（VIC）的炎癥和鈣化。然而，IFNs在VEC中的影響仍然未知。I型和II型IFNs、下游Janus 激酶（JAK）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器（如轉(zhuǎn)錄激活因子）在調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。在主動脈瓣中，一份報告顯示，IFN-γ在患病人瓣膜的鈣化區(qū)域表達。

主動脈瓣內(nèi)皮持續(xù)暴露于血流動力學(xué)力，對于維持瓣膜完整性和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。大多數(shù)指向VEC在CAVD中具有保護作用的證據(jù)都來自體外和離體模型。值得注意的是，鈣化主要發(fā)生在主動脈瓣的纖維層，這一過程可能由主動脈側(cè)（aVEC）或心室側(cè)（vVEC）內(nèi)皮細胞之間的特異性差異調(diào)節(jié)。主動脈瓣兩側(cè)出現(xiàn)顯著的血流動力學(xué)差異。主動脈表面暴露于振蕩性低剪切流，心室側(cè)暴露于層流高剪切流，這被認為會促進血管系統(tǒng)內(nèi)抗動脈粥樣硬化區(qū)域的存在。

在西班牙巴利亞多利德大學(xué)和西班牙國家研究委員會、倫敦帝國理工學(xué)院國家心肺研究所等研究團隊的一項實驗項目中，曾探討了IFNs對人類VEC的影響，重點關(guān)注炎癥、免疫細胞粘附和細胞遷移，并將其與典型的促炎細胞因子TNF-α的作用進行比較。此外，還分析了潛在的兩側(cè)特異性差異和流動模式的影響。研究結(jié)果可以為細胞因子及其在VEC中的相互作用提供新的見解，可能與理解CAVD的發(fā)生有關(guān)。相關(guān)研究成果發(fā)表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊題為“Interferons Are Pro-Inflammatory Cytokines in Sheared-Stressed Human Aortic Valve Endothelial Cells”。

首先，研究人員試圖調(diào)查人VEC是否對I型和II型IFNs有反應(yīng)，利用由瓣膜主動脈側(cè)和心室側(cè)細胞組成的混合VEC群，在靜態(tài)條件下與重組I型和II型IFNs（分別為IFN-α和IFN-γ）一起孵育。數(shù)據(jù)顯示，IFN-α和IFN-γ均促進VEC中酪氨酸701殘基處的STAT1磷酸化。為了闡明IFN誘導(dǎo)的表型，分析了與內(nèi)皮功能相關(guān)的基因的表達，即血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS3），分析顯示，IFNs不影響VEGFA和NOS3的表達。相比之下，TNF-α誘導(dǎo)VEGFA上調(diào)，說明兩種細胞因子在人VEC中具有不同效應(yīng)。

IFNs被認為是人VIC中促炎性細胞因子，因此研究了IFNs 的炎癥潛能。結(jié)果表明，在靜態(tài)條件下的VEC中，IFN-α和IFN-γ促進了炎癥主轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的激活。IFNs一致地上調(diào)下游基因的表達，即細胞間細胞粘附分子（ICAM）-1和血管細胞粘附分子（VCAM）-1。TNF-α是zui有xiao的促炎細胞因子。此外，qPCR分析顯示，IFN-α和IFN-γ增加了IL6基因的表達，然而，只有 IFN-α 增加了 IL8 表達，這表明 VEC 響應(yīng)中的 IFN 型特異性。總之，數(shù)據(jù)顯示，I型和II型IFN在從人類非鈣化瓣膜分離的VEC中是促炎細胞因子。

接下來，研究了從瓣膜主動脈側(cè)或心室側(cè)特異性分離的VEC中IFN-γ對缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α表達的潛在特異性反應(yīng)。為了模擬不同的剪切模式，在軌道振動臺渦流系統(tǒng)中培養(yǎng)并激活細胞，該系統(tǒng)在邊緣（單軸）和中心（多向）之間產(chǎn)生剪切應(yīng)力量的差異。

分析顯示，TNF-α，而非IFN-γ，在處理24小時后促進aVEC中的HIF-1α的穩(wěn)定，然而，IFN-γ和TNF-α之間的相互作用對于促進vVEC中的HIF-1α穩(wěn)定是必要的（圖1 A）。HIF-1α調(diào)節(jié)參與代謝和血管生成的幾個下游基因的表達，如VEGF-A。aVEC活化后，沒有細胞因子能促進VEGF-A的分泌（圖1 B）。

此外，TNF-α，而非IFN-γ，觸發(fā)了aVEC和vVEC中的NOS3蛋白下調(diào)（圖1 C），表明這些細胞因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮表型存在差異?？傊?，數(shù)據(jù)顯示，在剪切應(yīng)力條件下，IFN-γ和TNF-α對兩側(cè)特異性VEC中HIF-1α和NOS3表達有明顯影響。

圖1   TNF-α而不是IFN-γ促進了兩側(cè)特異性VEC中的HIF-1α的免疫誘導(dǎo)以及NOS3蛋白下調(diào)。（A-C）aVEC和vVEC暴露于剪切48小時，然后用zhi定的配體處理24小時。 

內(nèi)皮細胞遷移在血管生成中至關(guān)重要，并受HIF-1α調(diào)節(jié)。因此，分析了細胞因子在aVEC和vVEC的多軸剪切流下修復(fù)傷口愈合的能力。劃痕測定顯示，TNF-α和缺氧誘導(dǎo)劑氯化鈷2（CoCl2）在 aVEC 中促進傷口wan全愈合，但在 vVEC 中沒有。相反，IFN-γ顯著減少vVEC中的傷口愈合，并顯示出減少aVEC遷移的趨勢，并且還抑制了TNF-α介導(dǎo)的細胞遷移?？偟膩碚f，數(shù)據(jù)證明了瓣膜側(cè)和細胞因子在細胞遷移方面的差異。

接下來，分析了IFN-γ在兩側(cè)特異性VEC中誘導(dǎo)的炎癥表型。ELISA分析顯示，IFN-γ和TNF-α誘導(dǎo)IL-6分泌，其中TNF-α是zui有xiao的細胞因子，而兩種細胞因子合作增強了這種效果。此外，IFN-γ顯著促進了IP-10/CXCL10的分泌，而TNF-α誘導(dǎo)的分泌在aVEC中的分泌量顯著高于vVEC。

對于粘附分子表達，蛋白質(zhì)印跡表明，IFN-γ顯著誘導(dǎo)ICAM-1和VCAM-1，盡管程度低于TNF-α，并且aVEC和vVEC之間沒有顯著差異（圖2）。需要注意的是，HIF-1α的化學(xué)穩(wěn)定不影響粘附分子表達，這表明該轉(zhuǎn)錄因子不參與這些炎癥反應(yīng)（圖2）?？偟膩碚f，數(shù)據(jù)表明IFN-γ促進VEC的促炎表型，表現(xiàn)出與TNF-α的差異。

圖2   IFN-γ和TNF-α促進aVEC和vVEC中的粘附分子表達。將細胞暴露于剪切48小時，并用zhi定的配體處理24小時，并通過蛋白質(zhì)印跡分析全細胞提取物的ICAM-1和VCAM-1表達。

免疫細胞浸潤是CAVD最早的事件之一。為了闡明這一過程，實驗最后研究了多軸和單軸流動模式對單核細胞粘附到瓣膜內(nèi)皮細胞的影響。結(jié)果表明，IFN-γ 和 TNF-α 增加了多軸和單軸剪切流下單核細胞對aVEC 的粘附（圖3 A-D）。值得注意的是，THP-1粘附的數(shù)量和 THP-1/VEC 比值顯示，與孔的邊緣（單軸）相比，中心（多軸）的粘附量明顯更高（圖3 D）。此外，TNF-α與IFN-γ聯(lián)合進一步增強促粘附效應(yīng)（圖3 D）?？傊?，數(shù)據(jù)證明了IFN-γ和TNF-α對單核細胞粘附到aVEC單層的流動特異性影響。

圖3    IFN-γ和TNF-α在多軸剪切流條件下更高程度地促進單核細胞對aVEC單層的粘附

圖4    描述IFN在剪切應(yīng)力位點特異性VEC中影響的模式

（A）在靜態(tài)條件下的混合VEC中，IFN促進以誘導(dǎo)STAT1和NF-κB路線以及隨后的炎癥分子為特征的促炎表型。（B）兩側(cè)特異性VEC暴露于剪切流，細胞因子（IFN-γ，TNF-α）會促進炎癥。此外，在多軸剪切流條件下，aVEC更容易發(fā)生細胞因子介導(dǎo)的單核細胞粘附。最后，TNF-α和HIF-1α 的化學(xué)誘導(dǎo)劑（CoCl2）促進了遷移效應(yīng)，而IFN-γ降低了TNF-α介導(dǎo)效應(yīng)?？傊?，數(shù)據(jù)揭示了細胞因子和流動模式之間的差異。

總的來說，該研究數(shù)據(jù)揭示了關(guān)于IFNs在人VEC中的炎癥作用的新發(fā)現(xiàn)，顯示了TNF-α在遷移和NOS3下調(diào)方面的差異，還描述了多軸剪切流條件可能會增加免疫細胞對炎癥瓣膜內(nèi)皮細胞的粘附。這項研究提供了新的發(fā)現(xiàn)，這些發(fā)現(xiàn)可能與了解疾病的初始炎癥階段有關(guān)，并支持將JAK/STAT通路作為CAVD潛在相關(guān)途徑的研究。

參考文獻：Parra-Izquierdo I, Sánchez-Bayuela T, López J, Gómez C, Pérez-Riesgo E, San Román JA, Sánchez Crespo M, Yacoub M, Chester AH, García-Rodríguez C. Interferons Are Pro-Inflammatory Cytokines in Sheared-Stressed Human Aortic Valve Endothelial Cells. Int J Mol Sci. 2021 Sep 30;22(19):10605. doi: 10.3390/ijms221910605. PMID: 34638942; PMCID: PMC8508640.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34638942/

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