開發(fā)基于蛋白質(zhì)的產(chǎn)品需要了解它們在溶液中的表現(xiàn)，而測量樣品的Zeta電位可通過預(yù)測聚集行為，研究蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定性。但在實際測量過程中，Zeta電位明顯變化并不是電場本身導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的聚集，其變化的真正原因是蛋白質(zhì)與電極的接觸導(dǎo)致。

本文將介紹一種新的方法：擴散屏障法，可以提高測量樣品Zeta電位時的準確性和可重復(fù)性。

擴散屏障法通過引入一個較小的樣品量，用溶解蛋白質(zhì)的相同緩沖液將樣品與電極分離，因此電極對蛋白質(zhì)的影響大大降低。由于這種保護僅由樣品與電極的距離提供，在樣品擴散到電極之前，樣品都不會受其影響。而這一過程可能需要數(shù)小時，因為只測量了可溶性天然蛋白的遷移率，使得樣品的測量結(jié)果更加可靠。

一、樣品裝載

首先將溶解蛋白質(zhì)的緩沖液注入折疊毛細管樣品池中。然后將樣品池放入Zetasizer納米粒度電位儀中靜置2至3分鐘，使其溫度達到平衡。這將減少任何與溫度有關(guān)的流體運動，如對流。然后取出樣品池，通過圖1所示的槍頭將20~100 μL的樣品直接注入毛細管樣品池的最底部（圖2）。

圖 1 200μl的凝膠上樣移液槍頭

圖2 折疊毛細管孔中的凝膠移液槍頭，用于裝載擴散屏障方法的樣品量

圖3 裝樣對比圖：在10 mM NaCl中充滿藍色葡聚糖的樣品池（左）；樣品池填充10 mM NaCl，并加入50 μl藍色葡聚糖作為擴散屏障（右）

很明顯，樣品的藍色部分位于樣品池的測量體積中，距離樣品池頂部的電極有相當大的距離。如果樣品池保持直立并小心處理，樣品將不會在樣品池內(nèi)部擴散。在開始測量之前，應(yīng)使溫度達到平衡。

二、遷移率測量

理論上，使用擴散屏障法進行遷移率測量與在Zetasizer Nano中進行常規(guī)測量相同。在實際測樣過程中，離子強度較高的緩沖液會有較高的電導(dǎo)率，導(dǎo)致在給定電壓下焦耳加熱增加。需要進行一些手動改進，以提高使用擴散屏障法進行測量的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

為了避免顯著的焦耳熱，應(yīng)根據(jù)所使用的緩沖液的導(dǎo)電性來選擇電壓。如表1所示，在軟件中自動選擇適當?shù)碾妷?，隨著緩沖鹽的濃度增加，所用的電壓降低，并且運行次數(shù)最多為20次，以盡量減少焦耳熱。建議在兩次測量之間設(shè)置180秒的延遲，這也是為了確保測量之間的溫度平衡。

表1：給定濃度緩沖液的建議電壓和最大運行次數(shù)

Zetasizer軟件版本7及以上的蛋白質(zhì)遷移率測量類型將使所有這些設(shè)置自動化，使測量盡可能簡單。

一，粒徑分布變化

建議在zeta電位測量之前和之后都進行粒徑測量，以檢查樣品是否因電位測量而發(fā)生變化。如果遷移率測量影響了樣品并導(dǎo)致其聚集，這些聚集應(yīng)該出現(xiàn)在遷移率測量后的尺寸測量數(shù)據(jù)中。圖4A顯示了在任何遷移率測量之前的粒徑測量示例。該樣本不含聚集體，PDI為0.05。在常規(guī)的zeta電位測量后，聚集體已經(jīng)形成，PDI接近0.2（圖4B）。然而，當采用擴散屏障法時，沒有形成聚集體，遷移率測量后的PDI仍然低于0.05（圖4C）。

圖4A 樣品遷移率測量前的粒徑分布

圖4B 樣品常規(guī)遷移率測量后的粒徑分布

圖4C 使用擴散屏障法測量遷移率后的粒徑分布

二、頻率分布的對比

樣品中的聚集體將具有較低的布朗運動速度，從而在頻率圖中產(chǎn)生一個尖銳的峰值。因此，頻率圖中出現(xiàn)寬峰是識別高質(zhì)量數(shù)據(jù)的好方法。

圖5顯示了蛋白質(zhì)遷移率測量的兩個頻率圖。圖5A顯示了使用擴散屏障法重復(fù)測量的頻率寬峰，連續(xù)測量的圖重疊良好，表明沒有聚集物存在。圖5B顯示了未使用擴散屏障法的連續(xù)測量疊加圖。第一個測量是紅線，它顯示了廣泛的分布和良好的測量。然而，隨著測量的進行，由綠藍線和黑線表示，很明顯，一個大而尖銳的峰正在形成，這代表了在測量過程中聚集的樣品。多次測量的圖不一致，因此無法獲得可重復(fù)的遷移率測量。

圖5A 使用擴散屏障法進行的連續(xù)測量的頻率圖

圖5B：常規(guī)遷移率測量的頻率圖

焦耳熱是測量重復(fù)性下降的原因之一，而通過電導(dǎo)率的測量可以有效識別焦耳熱。為了盡量減少焦耳熱的影響，電導(dǎo)率應(yīng)限制在連續(xù)測量之間的增加不超過5-10%。如果它的增加超過這個值，則表明已經(jīng)發(fā)生了明顯的加熱，這可能會影響樣品并降低測量的可重復(fù)性。

至少要進行5次測量，以確保數(shù)據(jù)是可重復(fù)的。在方法開發(fā)過程中，建議測試一種廉價的替代蛋白質(zhì)，以優(yōu)化方法。