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【知識(shí)庫】如何做到蛋白質(zhì)電泳遷移率的精確可重復(fù)性測量?

來源:馬爾文帕納科   2023年10月27日 17:18  


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本文由馬爾文帕納科應(yīng)用專家周紫微、李航偉供稿




本文摘要

擴(kuò)散屏障法是一種通過最小化測量過程的影響來可靠地測量蛋白質(zhì)電泳遷移率的方法。蛋白質(zhì)與施加電場所用的電極接觸會(huì)導(dǎo)致樣品發(fā)生變性和聚集,導(dǎo)致Zeta電位明顯變化。本文記錄Zetasizer納米粒度電位儀利用擴(kuò)散屏障法將樣品分子與電極分離,可以很好地避免電極接觸對蛋白質(zhì)測量的影響。


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擴(kuò)散屏障法簡介

開發(fā)基于蛋白質(zhì)的產(chǎn)品需要了解它們在溶液中的表現(xiàn),而測量樣品的Zeta電位可通過預(yù)測聚集行為,研究蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定性。但在實(shí)際測量過程中,Zeta電位明顯變化并不是電場本身導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的聚集,其變化的真正原因是蛋白質(zhì)與電極的接觸導(dǎo)致。


本文將介紹一種新的方法:擴(kuò)散屏障法,可以提高測量樣品Zeta電位時(shí)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。


擴(kuò)散屏障法通過引入一個(gè)較小的樣品量,用溶解蛋白質(zhì)的相同緩沖液將樣品與電極分離,因此電極對蛋白質(zhì)的影響大大降低。由于這種保護(hù)僅由樣品與電極的距離提供,在樣品擴(kuò)散到電極之前,樣品都不會(huì)受其影響。而這一過程可能需要數(shù)小時(shí),因?yàn)橹粶y量了可溶性天然蛋白的遷移率,使得樣品的測量結(jié)果更加可靠。


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測量過程

一、樣品裝載


首先將溶解蛋白質(zhì)的緩沖液注入折疊毛細(xì)管樣品池中。然后將樣品池放入Zetasizer納米粒度電位儀中靜置2至3分鐘,使其溫度達(dá)到平衡。這將減少任何與溫度有關(guān)的流體運(yùn)動(dòng),如對流。然后取出樣品池,通過圖1所示的槍頭將20~100 μL的樣品直接注入毛細(xì)管樣品池的最底部(圖2)。

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圖 1 200μl的凝膠上樣移液槍頭

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圖2 折疊毛細(xì)管孔中的凝膠移液槍頭,用于裝載擴(kuò)散屏障方法的樣品量

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圖3 裝樣對比圖:在10 mM NaCl中充滿藍(lán)色葡聚糖的樣品池(左);樣品池填充10 mM NaCl,并加入50 μl藍(lán)色葡聚糖作為擴(kuò)散屏障(右)


很明顯,樣品的藍(lán)色部分位于樣品池的測量體積中,距離樣品池頂部的電極有相當(dāng)大的距離。如果樣品池保持直立并小心處理,樣品將不會(huì)在樣品池內(nèi)部擴(kuò)散。在開始測量之前,應(yīng)使溫度達(dá)到平衡。


二、遷移率測量


理論上,使用擴(kuò)散屏障法進(jìn)行遷移率測量與在Zetasizer Nano中進(jìn)行常規(guī)測量相同。在實(shí)際測樣過程中,離子強(qiáng)度較高的緩沖液會(huì)有較高的電導(dǎo)率,導(dǎo)致在給定電壓下焦耳加熱增加。需要進(jìn)行一些手動(dòng)改進(jìn),以提高使用擴(kuò)散屏障法進(jìn)行測量的數(shù)據(jù)質(zhì)量。


為了避免顯著的焦耳熱,應(yīng)根據(jù)所使用的緩沖液的導(dǎo)電性來選擇電壓。如表1所示,在軟件中自動(dòng)選擇適當(dāng)?shù)碾妷海S著緩沖鹽的濃度增加,所用的電壓降低,并且運(yùn)行次數(shù)最多為20次,以盡量減少焦耳熱。建議在兩次測量之間設(shè)置180秒的延遲,這也是為了確保測量之間的溫度平衡。


表1:給定濃度緩沖液的建議電壓和最大運(yùn)行次數(shù)

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Zetasizer軟件版本7及以上的蛋白質(zhì)遷移率測量類型將使所有這些設(shè)置自動(dòng)化,使測量盡可能簡單。


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評(píng)估數(shù)據(jù)質(zhì)量

一,粒徑分布變化


建議在zeta電位測量之前和之后都進(jìn)行粒徑測量,以檢查樣品是否因電位測量而發(fā)生變化。如果遷移率測量影響了樣品并導(dǎo)致其聚集,這些聚集應(yīng)該出現(xiàn)在遷移率測量后的尺寸測量數(shù)據(jù)中。圖4A顯示了在任何遷移率測量之前的粒徑測量示例。該樣本不含聚集體,PDI為0.05。在常規(guī)的zeta電位測量后,聚集體已經(jīng)形成,PDI接近0.2(圖4B)。然而,當(dāng)采用擴(kuò)散屏障法時(shí),沒有形成聚集體,遷移率測量后的PDI仍然低于0.05(圖4C)。


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圖4A 樣品遷移率測量前的粒徑分布

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圖4B 樣品常規(guī)遷移率測量后的粒徑分布

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圖4C 使用擴(kuò)散屏障法測量遷移率后的粒徑分布


二、頻率分布的對比


樣品中的聚集體將具有較低的布朗運(yùn)動(dòng)速度,從而在頻率圖中產(chǎn)生一個(gè)尖銳的峰值。因此,頻率圖中出現(xiàn)寬峰是識(shí)別高質(zhì)量數(shù)據(jù)的好方法。


圖5顯示了蛋白質(zhì)遷移率測量的兩個(gè)頻率圖。圖5A顯示了使用擴(kuò)散屏障法重復(fù)測量的頻率寬峰,連續(xù)測量的圖重疊良好,表明沒有聚集物存在。圖5B顯示了未使用擴(kuò)散屏障法的連續(xù)測量疊加圖。第一個(gè)測量是紅線,它顯示了廣泛的分布和良好的測量。然而,隨著測量的進(jìn)行,由綠藍(lán)線和黑線表示,很明顯,一個(gè)大而尖銳的峰正在形成,這代表了在測量過程中聚集的樣品。多次測量的圖不一致,因此無法獲得可重復(fù)的遷移率測量。

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圖5A 使用擴(kuò)散屏障法進(jìn)行的連續(xù)測量的頻率圖

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圖5B:常規(guī)遷移率測量的頻率圖


焦耳熱是測量重復(fù)性下降的原因之一,而通過電導(dǎo)率的測量可以有效識(shí)別焦耳熱。為了盡量減少焦耳熱的影響,電導(dǎo)率應(yīng)限制在連續(xù)測量之間的增加不超過5-10%。如果它的增加超過這個(gè)值,則表明已經(jīng)發(fā)生了明顯的加熱,這可能會(huì)影響樣品并降低測量的可重復(fù)性。


至少要進(jìn)行5次測量,以確保數(shù)據(jù)是可重復(fù)的。在方法開發(fā)過程中,建議測試一種廉價(jià)的替代蛋白質(zhì),以優(yōu)化方法。


結(jié)

Conclusion

通過應(yīng)用擴(kuò)散屏障法,可以有效消除在使用電泳光散射法進(jìn)行Zeta電位測量時(shí)蛋白質(zhì)樣品和電極的相互作用造成的聚集。通過最小化樣品體積并將蛋白質(zhì)與電極分離,這種新方法是一種簡單、強(qiáng)大的解決方案,可以在不損害蛋白質(zhì)本身的情況下對蛋白質(zhì)的遷移率進(jìn)行高度可重復(fù)的測量。




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Zetasizer Advance 系列

DLS & ELS 技術(shù)

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Zetasizer Advance 系列納米粒度電位分析儀可用于納米顆粒粒徑和穩(wěn)定性分析。

  • DLS動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)

  • 納米顆粒大小,Zeta電位及顆粒濃度

  • 粒度測量范圍:0.3nm-15μm

  • Zeta電位范圍:3.8nm-100μm



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