PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相似的技術(shù),其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是一個非常復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng),基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似,但反應(yīng)體系相對較簡單。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:
①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備。
②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合。
③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘, 2~3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。
注意事項:
1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,混勻并短暫離心。
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存。
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊。
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服。
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染。
7.實(shí)驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器。
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。
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