Taq DNA聚合酶的非特異擴增是PCR實驗中的常見問題，非特異擴增直接影響檢測結(jié)果的判讀并且會導(dǎo)致擴增靈敏度下降，甚至目標片段的得率下降等。利用酶修飾劑在常溫下封閉Taq DNA聚合酶酶活中心，抑制常溫下Taq酶的DNA聚合酶活性，是目前抑制非特異性擴增的方式。翌圣開發(fā)的雙封閉抗體，不僅可以封閉Taq DNA聚合酶的聚合酶活性，還能同時封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性，雙管齊下，既能有效防止錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增，又能防止物料降解產(chǎn)生非特異信號，雙重提升試劑特異性，使檢測試劑在運輸或室溫使用過程中都能夠從容應(yīng)對。

圖1.Yeasen雙封閉熱啟動Taq酶抗體產(chǎn)品

注：產(chǎn)品號 - CN202010666417.7

將合成的引物探針分別配于未封閉以及雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶的反應(yīng)液中，40℃反應(yīng)，檢測兩者熒光信號，發(fā)現(xiàn)雙封閉抗體可有效封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性。

圖2.雙封閉抗體外切酶活性封閉效率檢測

分別用翌圣雙封閉抗體以及T公司抗體對Taq 酶封閉后通過ARMS-PCR技術(shù)檢測陽性樣本，發(fā)現(xiàn)翌圣雙封閉抗體封閉的Taq酶在ARMS-PCR擴增中分型準確，靈敏度更高。

圖3.ARMS-PCR擴增曲線圖

用傳統(tǒng)封閉抗體與雙封閉抗體分別封閉Taq DNA聚合酶，配置成含引物探針的全預(yù)混液，在4℃放置10天或在37℃放置1、3、5天，擴增10000拷貝ASF質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)擴增曲線和Ct值無明顯變化。 

圖4.傳統(tǒng)封閉抗體（A）及翌圣雙封閉抗體（B）封閉的Taq酶，配成全預(yù)混的qPCR反應(yīng)液在4℃放置10天后擴增104拷貝ASF質(zhì)粒的擴增曲線圖

圖5.傳統(tǒng)封閉抗體（A）及翌圣雙封閉抗體（B）封閉的Taq酶，配成全預(yù)混的qPCR反應(yīng)液在37℃放置5天后擴增104拷貝ASF質(zhì)粒的擴增曲線圖

某些引物配合特定buffer和儀器時，會出現(xiàn)基線上漂的情況，但雙封閉抗體能解決基線上漂問題，更有利于基線平穩(wěn)。

圖6.ASFV基因（A）、ACT基因(B)擴增曲線圖

用雙封閉抗體封閉的反應(yīng)液擴增100000、10000、1000、100拷貝ASFV/ACT雙質(zhì)粒，制作標準曲線。由圖7可以看到，兩者線性均良好。

圖7. 雙封閉反應(yīng)液制作ASFV基因、ACT基因標準曲線圖

分別用進口T公司抗體和翌圣雙封閉抗體（Cat#31303）封閉Taq酶，并在95℃下熱激20 s，檢測酶活?？梢钥吹?5℃熱激20 s后，31303可釋放95%以上的酶活，與T公司抗體相當(dāng)。

表1.95℃下熱激20 s酶活

使用翌圣雙封閉抗體（Cat#31303）分別封閉三種類型Taq酶（1種野生型+2種突變型），封閉比例為1μg : 50U，通過熒光值定量法檢測封閉效率。結(jié)果顯示，對于不同類型的Taq酶，翌圣雙封閉抗體（Cat#31303）封閉效果均較好。

表2.不同類型Taq酶的封閉效率

以水為模板作為陰性對照，小鼠基因組為模板作為陽性對照，擴增不同批次的31303，觀察條帶，發(fā)現(xiàn)樣品未擴增出目的片段，說明抗體不存在小鼠基因組殘留。

圖8 小鼠基因組殘留檢測圖

注：-為陰性對照，+為陽性對照，1-5為31303不同批次樣品