機(jī)械負(fù)荷通過(guò)調(diào)節(jié)骨重塑在維持骨穩(wěn)態(tài)中起重要作用。骨細(xì)胞是嵌入礦化骨基質(zhì)中zui豐富的細(xì)胞類(lèi)型，是控制骨重塑以響應(yīng)機(jī)械力的主要機(jī)械傳感器。骨細(xì)胞機(jī)械傳感特性導(dǎo)致不同類(lèi)型的受體和不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活。骨細(xì)胞也是核因子κB配體受體激活子（RANK-L）的主要來(lái)源，并且可以通過(guò)下調(diào)RANK-L與骨保護(hù)素的比例來(lái)負(fù)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化以響應(yīng)機(jī)械負(fù)荷。

YES相關(guān)蛋白（YAP）和具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（TAZ）首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是發(fā)育過(guò)程中器官生長(zhǎng)的主要調(diào)節(jié)因子。YAP/TAZ受到機(jī)械和細(xì)胞骨架信號(hào)的調(diào)節(jié)，并作為機(jī)械轉(zhuǎn)換器控制細(xì)胞命運(yùn)，以響應(yīng)細(xì)胞微環(huán)境的特性。YAP/TAZ與不同的成骨細(xì)胞發(fā)生信號(hào)通路相互作用，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白通路和Wnt/β-catenin信號(hào)通路。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，YAP/TAZ在成骨細(xì)胞生成過(guò)程中的機(jī)械敏感性中起作用。以往研究還在骨細(xì)胞系MLO-Y4中證明，Piezo 介導(dǎo)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)并誘導(dǎo)YAP / TAZ核易位以響應(yīng)剪切應(yīng)力。

鑒于這些發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)提出了YAP/TAZ在骨細(xì)胞中的潛在作用的問(wèn)題，特別是在響應(yīng)3D機(jī)械負(fù)荷時(shí)。因此，在法國(guó)巴黎拉里布瓦西埃醫(yī)院、巴黎大學(xué)健康學(xué)院及英國(guó)曼徹斯特曼徹斯特大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院聯(lián)合研究的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中利用了一種新的承受壓縮應(yīng)力的3D培養(yǎng)模型來(lái)表征骨細(xì)胞樣細(xì)胞系MLO-Y4在機(jī)械負(fù)荷下的反應(yīng)。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 Laboratory Investigation 期刊題為“Mechanical loading activates the YAP/TAZ pathway and chemokine expression in the MLO-Y4 osteocyte-like cell line”。

首先，為了確定骨細(xì)胞樣細(xì)胞系響應(yīng)機(jī)械負(fù)荷的最佳條件，實(shí)驗(yàn)對(duì)MLO-Y4細(xì)胞使用了循環(huán)機(jī)械2D拉伸和3D壓縮。將循環(huán)或靜態(tài)拉伸應(yīng)用于2D細(xì)胞培養(yǎng)模型，拉伸百分比、頻率、信號(hào)形式和拉伸持續(xù)時(shí)間是可調(diào)的，MLO-Y4培養(yǎng)物以0.3 Hz的正弦波形和3%伸長(zhǎng)率進(jìn)行接受9小時(shí)的等雙軸動(dòng)態(tài)拉伸。此外，在體外壓縮裝置將3D MLO-Y4培養(yǎng)物置于0-40 kPa的循環(huán)壓縮下，以1 Hz的正弦波形持續(xù)9小時(shí)。與2D拉伸和卸載機(jī)械條件相比，3D培養(yǎng)壓縮激活了某些機(jī)械敏感基因，例如E11和COX2編碼Ptgs2（圖1 A）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇了3D骨細(xì)胞壓縮模型。

骨細(xì)胞樣細(xì)胞系MLO-Y4機(jī)械負(fù)荷導(dǎo)致YAP/TAZ通路的激活，如靶基因Ankdr1和Tead4的表達(dá)增加所示（圖1 B），免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)了YAP/TAZ信號(hào)的激活，并量化了核易位，這在機(jī)械負(fù)荷下增加（圖1 C）。3D壓縮不僅降低了Yap表達(dá)，而且增加了Taz表達(dá)（圖1 D）。此外，3D壓縮增強(qiáng)了YAP/TAZ的蛋白表達(dá)，從而表明YAP/TAZ蛋白的穩(wěn)定（圖1 E）。為了確認(rèn)體內(nèi)骨細(xì)胞YAP / TAZ的表達(dá)，在6月齡的小鼠股骨中進(jìn)行抗體標(biāo)記，在皮質(zhì)骨和小梁骨中均發(fā)現(xiàn)YAP/TAZ染色。

圖1     YAP/TAZ活化和核易位的分析。

（A）通過(guò)實(shí)時(shí) qPCR 評(píng)估的 E11/gp38 和 Ptsg2（編碼 COX-2）基因表達(dá)，以響應(yīng) 2D（拉伸）或 3D 培養(yǎng)（壓縮）中的機(jī)械負(fù)荷。（B）機(jī)械加載后通過(guò)實(shí)時(shí)qPCR評(píng)估的 YAP/TAZ 靶基因表達(dá)。（C）免疫熒光測(cè)量的 YAP/TAZ 核易位YAP/TAZ（綠色）和細(xì)胞核（DAPI，藍(lán)色）的圖像。（D）通過(guò)實(shí)時(shí)qPCR 檢測(cè)機(jī)械負(fù)荷對(duì)YAP1和WWTR1 （TAZ）基因表達(dá)的影響。（E）MLO-Y4中YAP和TAZ的免疫印跡在3D培養(yǎng)中進(jìn)行機(jī)械加載。

接下來(lái)，通過(guò)RNAseq確定由作為骨細(xì)胞機(jī)械傳感過(guò)程一部分的YAP/TAZ調(diào)節(jié)的生物過(guò)程。首先篩選Yap/Taz shRNA敲低的細(xì)胞，基于Yap和Taz shRNA的沉默足以降低YAP/TAZ mRNA和蛋白質(zhì)水平。

RNAseq分析證明，無(wú)論YAP/TAZ敲低如何，負(fù)荷成分占方差的大部分，這表明負(fù)荷因子的影響很大（圖2 A）。圖2 B-D顯示了MA 圖，即對(duì)數(shù)平均值（A值）與log2倍變化（M值）的對(duì)比圖。在對(duì)照細(xì)胞中，Cxcl2是機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)的上調(diào)幅度最大的基因（圖2 B）。與YAP/TAZ缺失相比，3D負(fù)荷誘導(dǎo)了更多的富集基因（圖2 B），從而避免了由這些轉(zhuǎn)錄共激活因子沉默引發(fā)的離散基因譜。在機(jī)械負(fù)荷下，YAP或TAZ缺失的基因反應(yīng)反應(yīng)有一定的相似性，表明存在一定程度的富集。Fbn2是機(jī)械負(fù)荷下骨細(xì)胞中YAP和TAZ個(gè)體缺失下上調(diào)的基因之一。此外，YAP和TAZ的沉默是有效的，因?yàn)檫@兩種轉(zhuǎn)錄輔助因子都是下調(diào)最多的基因之一（圖2 C、D）。

圖2   主成分分析和MA（比率強(qiáng)度）圖。

（A）機(jī)械負(fù)荷（主成分1 ，PC1）和 YAP/TAZ 沉默（主成分2 ，PC2）的主成分分析 （PCA）。（B-D）散點(diǎn)圖描述了兩個(gè)條件之間變化的分布（在y軸上：（B）shControl 卸載與 shControl 負(fù)載；（C）shControl 負(fù)載與shYAP 負(fù)載；（D）shControl 負(fù)載與 shTAZ 負(fù)載）。下調(diào)和上調(diào)基因分別以紅色和綠色表示。

此外，GO分析用于鑒定骨細(xì)胞樣細(xì)胞系MLO-Y4中機(jī)械負(fù)荷下由YAP/TAZ調(diào)節(jié)的生物過(guò)程。結(jié)果表明，TEAD1和TEAD2是通過(guò)YAP響應(yīng)機(jī)械負(fù)荷而調(diào)節(jié)的主要基因之一，因?yàn)閅AP的缺失突出了導(dǎo)致這些GO terms 的基因的改變。細(xì)胞加載后，與樹(shù)突形態(tài)發(fā)生相關(guān)的幾個(gè)GO terms 被突出顯示，從而提示YAP和TAZ在骨細(xì)胞功能與腔隙-小管系統(tǒng)之間的關(guān)系中所起的作用。

最后，由于Cxcl2是機(jī)械負(fù)荷后MLO-Y4骨細(xì)胞中上調(diào)最多的基因，因此RNAseq分析的一部分重點(diǎn)關(guān)注機(jī)械負(fù)荷對(duì)趨化因子表達(dá)的影響。機(jī)械應(yīng)變誘導(dǎo)對(duì)照細(xì)胞（shRNA對(duì)照）中Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl9、Cxcl10和Csf1水平大幅增加。然而，YAP和TAZ的缺失消除了Cxcl3、Cxcl9、Cxcl10和Csf1水平的升高。為了確認(rèn)在YAP/TAZ調(diào)節(jié)方面與趨化因子表達(dá)相關(guān)的RNAseq結(jié)果，實(shí)驗(yàn)使用了實(shí)時(shí)qPCR分析，觀察到機(jī)械負(fù)荷確實(shí)增加了對(duì)照細(xì)胞中Csf1（M-CSF）、Cxcl3、Cxcl9和Cxcl10的水平（圖3）。沉默 YAP/TAZ 部分減弱了機(jī)械負(fù)荷后 Csf1 和 Cxcl3 的上調(diào)。相比之下，響應(yīng)機(jī)械負(fù)荷上調(diào)的Cxcl10和Cxcl9表達(dá)不依賴(lài)于YAP/TAZ。這說(shuō)明YAP/TAZ介導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞樣細(xì)胞系機(jī)械誘導(dǎo)的趨化因子表達(dá)。

圖3   通過(guò)RT-qPCR評(píng)估機(jī)械負(fù)荷后YAP/TAZ敲低對(duì)趨化因子表達(dá)的影響。

通過(guò)實(shí)時(shí)qPCR檢測(cè)YAP/TAZ缺失的MLO-Y4細(xì)胞中CSF-1 (M-CSF)、CXCL3、CXCL9和CXCL10 mRNA的表達(dá)。

在這項(xiàng)研究中，利用MLO-Y4細(xì)胞開(kāi)發(fā)了一種創(chuàng)新的3D骨細(xì)胞樣細(xì)胞系培養(yǎng)壓縮系統(tǒng)，以探索機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)的基因修飾，并確定YAP/TAZ信號(hào)是否在細(xì)胞中起機(jī)械敏感介質(zhì)的作用。該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍軌蛟谟蒊型膠原組成的3D培養(yǎng)中研究骨細(xì)胞的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而代表了一個(gè)更生理相關(guān)的環(huán)境，還允許應(yīng)用機(jī)械壓縮水平，概括作用在骨骼上的不同力，例如張力、流體剪切力和壓縮力。

總之，該研究結(jié)果提供了第一個(gè)證據(jù)，證明YAP/TAZ在3D機(jī)械刺激后在骨細(xì)胞樣細(xì)胞中被激活并調(diào)節(jié)趨化因子表達(dá)。研究結(jié)果表明，YAP/TAZ代表骨細(xì)胞樣細(xì)胞中機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子，還證明了，骨細(xì)胞MLO-Y4細(xì)胞是不同趨化因子的主要來(lái)源，特別是Cxcl3、Cxcl9和Cxcl10，這些趨化因子是在機(jī)械負(fù)荷下釋放的。

參考文獻(xiàn)：Zarka M, Etienne F, Bourmaud M, Szondi D, Schwartz JM, Kampmann K, Helary C, Rannou F, Ha? E, Cohen-Solal M. Mechanical loading activates the YAP/TAZ pathway and chemokine expression in the MLO-Y4 osteocyte-like cell line. Lab Invest. 2021 Dec;101(12):1597-1604. doi: 10.1038/s41374-021-00668-5. Epub 2021 Sep 14. PMID: 34521992.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34521992/

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