破骨細胞（OCs）是多核巨細胞，在病理刺激的影響下（如核因子κβ配體的受體激活劑RANKL），由單核細胞/巨噬細胞譜系分化而來，有助于骨吸收和重塑。成骨細胞（OB）、OCs、骨細胞和其他骨髓細胞之間精確而有序的分子通訊是調(diào)節(jié)骨形成和吸收所必需的。破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收的主要開關(guān)是RANKL，一種由活化OBs釋放的細胞因子。然而，在各種病理條件下，如關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥和佩吉特骨病，OC介導(dǎo)的骨過度吸收是很明顯的。

骨質(zhì)破壞的本質(zhì)是通過與滑膜成纖維細胞和免疫細胞相互作用專門激活了OCs。差異激活的巨噬細胞在各種類型的細胞骨架和其他炎癥相關(guān)疾病的病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用，一般來說，M1和M2骨髓細胞分別參與引發(fā)和消退炎癥。因此，調(diào)節(jié)巨噬細胞極性的細胞治療策略可能通過影響骨質(zhì)疏松癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病中不受控制的破骨細胞分化來提供顯著優(yōu)勢。

骨保護素（OPG）是TNF受體超家族的分泌性糖蛋白，對成骨細胞分化至關(guān)重要，由于其在抑制破骨細胞分化中的作用，也被稱為破骨細胞生成抑制因子（OCIF）。OBs通過產(chǎn)生OPG來負調(diào)節(jié)OC的分化和功能。研究表明，OPG抑制OC分化，并通過隔離RANKL充當(dāng)誘餌受體，可阻斷 RANK 信號并抑制骨吸收。

牙髓來源的干細胞（DPSCs）是自牙髓中分離的一種間充質(zhì)干細胞，具有自我更新、多向分化能力，并具有促進血管生成和骨組織修復(fù)潛力。此外，DPSCs還被證明具有免疫抑制作用，提示人類DPSCs可用于炎癥和自身免疫性疾病，DPSCs分泌多種生長因子和細胞因子，這些因子對各種細胞具有旁分泌活性，以實現(xiàn)其功能和分化。

基于此，美國德克薩斯理工大學(xué)健康科學(xué)中心的一項研究曾重點闡明了單核細胞/巨噬細胞樣細胞系 DPSCs對單核細胞/巨噬細胞樣細胞系 RAW 264.7 細胞分化為OCs發(fā)揮抑制作用的潛在機制。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 Journal of Cellular and Molecular Medicine 期刊題為“Dental pulp–derived stem cells inhibit osteoclast differentiation by secreting osteoprotegerin and deactivating AKT signalling in myeloid cells”。

首先，為了研究DPSCs對破骨細胞分化的影響，在有或沒有DPSCs 狀態(tài)下在無接觸共培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)破骨細胞前體細胞（RAW 264.7），同時，細胞培養(yǎng)基補充巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）和sRANKL以誘導(dǎo)其向破骨細胞方向分化。TRAP染色顯示，在用M-CSF和sRANKL刺激的細胞培養(yǎng)板中觀察到多核破骨細胞，而沒有M-CSF和sRANKL培養(yǎng)的對照RAW 264.7細胞中沒有顯示任何多核TRAP陽性細胞。然而，在DPSCs存在時，同一時間點的多核TRAP陽性細胞的豐度明顯降低。當(dāng)DPSC：RAW 264.7細胞比例為1:10時，觀察到破骨細胞豐度的劑量依賴性減少，其抑制作用比細胞比例為1：100時更有效。與沒有DPSCs的RAW 264.7細胞相比，在無接觸共培養(yǎng)條件下，在DPSCs存在下分化的RAW 264.7細胞中TRAP陽性的多核細胞數(shù)量明顯減少。這些觀察表明，DPSCs能夠抑制破骨細胞分化。

然后，進一步驗證了DPSCs對破骨細胞分化的影響，在存在或不存在無接觸DPSCs共培養(yǎng)的情況下，評估了RAW 264.7細胞在誘導(dǎo)分化6天后各種破骨細胞相關(guān)標(biāo)記基因的mRNA表達。定量PCR分析顯示，分化后的破骨細胞相關(guān)基因，如Nfatc1、組織蛋白酶K（Ctsk）、Rank、Trap和MMP9等關(guān)鍵基因顯著上調(diào)。這些結(jié)果證實了RAW 264.7細胞成功分化為OCs。然而，在DPSCs存在下，破骨細胞相關(guān)標(biāo)記基因（如Nfatc1、Ctsk、Rank、Trap和Mmp9）的mRNA表達以劑量依賴性方式顯著降低。

為了確認(rèn)基因表達向蛋白質(zhì)的翻譯，在分化6天后，對分離的總蛋白質(zhì)進行了蛋白質(zhì)印跡分析。與未分化細胞相比，破骨細胞分化細胞中NFATc1、Ctsk、MMP9和p65的蛋白質(zhì)水平顯著升高，然而，當(dāng)在DPSC以劑量依賴性方式存在誘導(dǎo)分化時，蛋白質(zhì)水平明顯降低。此外，與對照RAW 264.7細胞相比，分化細胞中的NFATc1、Ctsk、MMP9和TRAP陽性多核OCs顯著增加（圖1 A、B），而在DPSCs存在下觀察到分化相關(guān)蛋白的數(shù)量顯著減少（圖1 A、B）。

圖1    DPSCs抑制RAW 264.7細胞中的破骨細胞分化相關(guān)分子。

DPSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用，并可能進一步調(diào)節(jié)破骨細胞分化過程。因此，接下來測試了DPSCs在RAW 264.7細胞中是否有任何免疫調(diào)節(jié)作用，在存在或不存在DPSCs的情況下對RAW 264.7細胞進行了無接觸共培養(yǎng)。與對照組相比，在DPSCs存在下，炎癥基因之一TNF-α的表達顯著下調(diào)（圖2 A），相反，IL-4Rα，一種抗炎基因的mRNA表達上調(diào)（圖2 A）。此外，作為RAW 264.7細胞M2表型特征的精氨酸酶1（Arg1），Ym1（Chil3）顯著增加（圖2 B）。這些數(shù)據(jù)表明，DPSCs可能具有將巨噬細胞極化為抗炎表型的能力，從而負向調(diào)節(jié)破骨細胞的分化。

為了進一步了解DPSCs調(diào)節(jié)骨髓細胞分化的機制，在無接觸共培養(yǎng)條件下在存在或不存在DPSCs的情況下，還評估了RAW 264.7細胞在誘導(dǎo)分化6天后破骨細胞抑制因子骨保護素（OPG）的基因和蛋白質(zhì)表達。定量PCR分析顯示，誘導(dǎo)破骨細胞分化6 天后，RAW 264.7細胞OPG mRNA顯著降低。然而，在DPSCs存在下誘導(dǎo)RAW 264.7細胞分化為OCs時，OPG的mRNA表達以劑量依賴性方式顯著增加。然后，使用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)確定了哪些細胞在OCs分化過程中分泌OPG，發(fā)現(xiàn)從對照 RAW 264.7 細胞或分化 OCs 收集的上清液中沒有可檢測到的 OPG 范圍。然而，在整個分化過程中，在DPSCs存在下，培養(yǎng)上清液中的OPG水平顯著升高。這些結(jié)果表明，RAW 264.7細胞可能沒有分泌OPGs。

圖2   DPSCs抑制促炎基因和誘導(dǎo)M2表型分子抗炎基因的表達。

進一步地，為了確定DPSC是否可以表達和分泌組成型DPSCs，在不同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)DPSCs，在血清饑餓條件下（含1% FBS的DMEM），在培養(yǎng)48和72小時后收集上清液。OPG的mRNA表達顯示，與用含10% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)的DPSCs相比，血清饑餓在兩個時間點均顯著誘導(dǎo)DPSCs中的OPG表達。然后測量了上清液中分泌的OPG量，發(fā)現(xiàn)血清饑餓后OPG水平顯著升高。進一步研究的證實了DPSC在含10% FBS和在受損環(huán)境下的培養(yǎng)基中均分泌了OPG。這些觀察表明，DPSCs可以在脅迫條件下分泌組成型OPG，培養(yǎng)基對OPG分泌沒有顯著影響。

為了研究OPG對破骨細胞分化相關(guān)分子的影響，在存在或不存在不同濃度的重組OPG的情況下誘導(dǎo)了RAW 264.7細胞的破骨細胞分化，并進行了實時RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析。分析顯示，在破骨細胞分化6天后，在OPG存在下，關(guān)鍵的破骨細胞相關(guān)基因（如Nfatc1、Ctsk、Rank、Trap和Mmp9）顯著降低（圖3 A）。此外，與分化的OCs相比，存在OPG時，關(guān)鍵破骨細胞相關(guān)蛋白NFATc1、Ctsk 和MMP9水平降低（圖3 B）。這些觀察結(jié)果支持OPG抑制破骨細胞分化相關(guān)標(biāo)志物分子的能力。

圖3    重組OPG以劑量依賴性方式抑制破骨細胞分化相關(guān)分子。

最后，為了確定DPSC介導(dǎo)的抑制骨髓細胞破骨細胞分化的分子機制，在存在或不存在各種濃度的重組OPG或PI3K抑制劑或DPSCs的情況下誘導(dǎo)RAW 264.7細胞分化。首先，較高濃度（50 ng/mL和100 ng/mL）的OPG顯著抑制了OCs的分化，而較低濃度（5 ng/mL和25 ng/mL）的OPG對抑制破骨細胞分化的作用不大（圖4 A、B）。

蛋白質(zhì)印跡分析顯示，活化的AKT（磷酸化AKT）在OCs中上調(diào)，而OPG的添加以濃度依賴性方式抑制AKT的活化（圖4 C）。在無接觸共培養(yǎng)中存在DPSCs的情況下，也觀察到AKT活化（磷酸化）的抑制（圖4 D）。這些數(shù)據(jù)表明，DPSC介導(dǎo)的破骨細胞分化抑制模仿了OPG介導(dǎo)的破骨細胞分化抑制的信號級聯(lián)反應(yīng)。通過使用PI3K特異性抑制劑進一步證實了PI3K-AKT通路在破骨細胞分化過程中的參與，發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑以劑量依賴性方式顯著降低了破骨細胞分化（圖4 E、F）。

為了確定DPSC是否通過OPG抑制RAW 264.7細胞的破骨細胞分化，實驗在Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)中在存在或不存在DPSC或DPSC加抗OPG Ab的情況下誘導(dǎo)破骨細胞分化。TRAP染色顯示，DPSC的存在降低了破骨細胞分化，并且在培養(yǎng)物中加入抗OPG Ab以及DPSC以劑量依賴性方式顯著恢復(fù)了破骨細胞分化。這些結(jié)果證實了OPG介導(dǎo)的對破骨細胞分化的抑制部分通過DPSC。

圖4     DPSC模仿OPG介導(dǎo)的信號通路（PI3K）來抑制破骨細胞分化。

總之，該研究表明，人類DPSCs通過組成性分泌OPG，降低RAW 264.7細胞中關(guān)鍵OC標(biāo)志物（如NFATc1、Ctsk、TRAP、RANK和MMP-9）的表達來抑制破骨細胞的發(fā)生。OPG可能會阻斷RANK-RANKL相互作用，這對于OCs的分化至關(guān)重要。此外，DPSCs降低了RAW 264.7細胞的炎癥信號，并將RAW 264.7細胞極化為M2表型，從而抑制破骨細胞分化。研究進一步證實，在OC分化過程中，OPG介導(dǎo)的PI3K信號通路（AKT）激活的抑制趨勢與DPSC介導(dǎo)的OC分化抑制相似。使用抗OPG抗體的挽救實驗部分證實了OPG介導(dǎo)的DPSCs抑制OC分化的可能性。這項研究提供了DPSC介導(dǎo)的破骨形成機制抑制的證據(jù)。

參考文獻：Kanji S, Sarkar R, Pramanik A, Kshirsagar S, Greene CJ, Das H. Dental pulp-derived stem cells inhibit osteoclast differentiation by secreting osteoprotegerin and deactivating AKT signalling in myeloid cells. J Cell Mol Med. 2021 Mar;25(5):2390-2403. doi: 10.1111/jcmm.16071. Epub 2021 Jan 28. PMID: 33511706; PMCID: PMC7933945.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33511706/

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