Topoisomerase I 助力5min完成克隆

來源：翌圣生物科技（上海）股份有限公司 2023年11月24日 17:29

拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topoisomerase) 是存在于細(xì)胞核內(nèi)的一類酶，它們能夠切斷單鏈或雙鏈DNA的磷酸二酯鍵，然后重新纏繞和封口來更正DNA連環(huán)數(shù)，從而控制DNA的拓?fù)錉顟B(tài)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶分為兩類，I型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNA Topoisomerase I）和II型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA Topoisomerase II）。

Topoisomerase I是由美國科學(xué)家Stewart Shuman在1990年從牛痘病毒中發(fā)現(xiàn)的，同時具有限制性內(nèi)切酶活性和連接酶活性，能夠在DNA復(fù)制過程中切斷并重新連接DNA。Topoisomerase I可以在無需ATP供能的情況下切斷DNA鏈，在切割單鏈DNA后，會與末端DNA片段形成暫時性中間體，并在釋放壓力后重新連接切口。由于Topoisomerase I具有切斷、連接DNA的這種特性，常被用于克隆載體的構(gòu)建（如TOPO克隆）以及NGS 建庫中的接頭連接等。

圖1. Topoisomerase I原理圖[1]

TOPO克隆

TOPO克隆是一種基于Topoisomerase I的PCR產(chǎn)物快速克隆系統(tǒng)，利用Topoisomerase I的連接原理，無需DNA連接酶，可在5 min內(nèi)高效連接DNA片段。Topoisomerase I識別并切割TOPO載體上的結(jié)合位點(diǎn)，切割完成后，與TOPO載體結(jié)合形成復(fù)合物。目的DNA片段可在Topoisomerase I的作用下與TOPO載體連接，形成克隆。

技術(shù)路線

識別切割：Topoisomerase I識別DNA序列5’-(C/T)CCTT-3’，并且能夠在該位點(diǎn)對DNA進(jìn)行切割；

固定：Topoisomerase I借助DNA斷裂的能量將酪氨酸殘基與載體DNA 3’末端形成共價鍵，從而固定在DNA載體上；

連接：在加入目的DNA片段（PCR Product）后，目的DNA片段的5'端羥基攻擊載體片段的磷酸鍵，釋放能量，使得目的DNA片段的 5'端羥基與載體片段的3'端磷酸基團(tuán)連接在一起；

脫落：Topoisomerase I從載體分子上脫落。

圖2. TOPO原理圖

翌圣Topoisomerase I

翌圣Topoisomerase I (Cat#14971ES)由翌圣鎂孚泰生物ZymeEditor酶進(jìn)化平臺經(jīng)過重組表達(dá)獲得，無外切酶殘留、低宿主殘留，可應(yīng)用于NGS 建庫中的接頭連接、TOPO克隆等！

部分?jǐn)?shù)據(jù)展示

應(yīng)用到TOPO克隆，克隆效果優(yōu)于A品牌

使用不同批次的Topoisomerase I進(jìn)行TOPO克隆，分別連接2 kb的粘性末端、4 kb的平末端，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，翌圣Topoisomerase I運(yùn)用到TOPO克隆中，克隆效果優(yōu)于A品牌，陽性克隆率達(dá)100%（8/8）。

圖3. Topoisomerase I運(yùn)用到TOPO克隆效果圖

外切酶殘留

將50 U不同批次的Topoisomerase I分別與相應(yīng)的底物DNA在37℃孵育4 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，翌圣Topoisomerase I無外切酶殘留。

圖4. 外切酶殘留檢測

E. coli基因組DNA殘留< 1 copy/5U

對不同批次的Topoisomerase I (Cat#14971ES)進(jìn)行E. coli基因組DNA殘留檢測，結(jié)果顯示翌圣Topoisomerase I宿主基因組DNA殘留遠(yuǎn)低于1 copy/5U。

圖5. E. coli基因組DNA殘留檢測

產(chǎn)品推薦

產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號	產(chǎn)品規(guī)格
Topoisomerase I	14971ES	100 / 500 U

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