點擊序列如智人KIR3DL2蛋白的mRNA序列（KIR3DL2基因），進入界面后會給出該基因的來源物種、詳細名稱、功能描述、文獻出處、核酸序列及氨基酸序列信息等信息。點擊右上角的“Send to”可以獲得該基因的完整序列（純文本格式）。

圖2. NCBI基因序列下載

獲得目的片段后，根據(jù)同源重組原理，需要在插入片段的上下游引入15-25 bp的同源臂，GC含量40-60%，以保證片段與載體充分接觸并進行重組。可以通過翌圣“支持中心”的“同源重組引物設計”點擊進入，或者直接點擊無縫克隆引物設計軟件  進行設計引物。輸入需要的載體序列和目的片段序列，選擇合適的酶切位點（不建議選擇載體和片段中都含有的酶切位點），生成引物，如圖3、4所示。

圖3. 翌圣設計軟件

圖4. 翌圣引物設計流程

值得注意的是，多個目的片段插入的雙酶切位點，實際添加到第一個片段的5’端和最后一個片段的3’端，中間片段不含有設計的酶切位點。通過引物合成公司合成需要的引物序列。接著使用翌圣高保真PCR試劑盒（Cat#10164ES）PCR擴增目的片段與載體。

當設計完目的片段后，需要對載體和片段進行模擬連接，保證實驗的準確性?？梢允褂肧napgene軟件模擬。以pUC19為載體，KIR3DL2基因為插入片段，進行克隆連接模擬。選擇“Actions”—“Gibson Assembly”—“Insert Fragment”，輸入相應的插入片段和載體序列，如下圖5所示，即可生成連接后的載體。點擊新生成載體的“History”可以模擬載體與片段連接的具體步驟，如圖6所示。

圖5. Snapgene同源重組模擬流程

圖6. Snapgene同源重組模擬圖

模擬步驟后，即可使用翌圣新品通用型多片段快速克隆試劑盒（Cat#10923ES）連接目的片段，該試劑盒滿足6 μL小體系、10 ng低濃度載體與片段的連接，菌落數(shù)多，克隆陽性率高，客戶反饋效果好，如圖7所示。

實驗信息：載體大小：5369 bp；目的片段大小：1589 bp。

實驗數(shù)據(jù)：

圖7. 10923ES在10 μL小反應體系下，低濃度載體（30 ng）連接單片段，陽性率100%。A：重組轉化平板。B：插入片段PCR鑒定電泳圖，泳道1-5分別為菌落1，菌落2，陰性對照，陽性對照（基因組作為模版），陽性對照（PCR純化片段作為模版）。（上海交通大學）

除了上述基礎的分子克隆技術應用工具外，還有如紐約大學研究人員開發(fā)的gRNA在線設計軟件    ，用于設計CRISPR-Cas13的gRNA引物等。分子克隆應用工具多種多樣，應用好工具，能為我們的實驗添磚加瓦。小翌在這里祝您實驗順利，一氣呵成！關注我們，小翌會在下一期繼續(xù)帶來分子克隆方面的知識，為您的實驗帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~