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PCR之引物設(shè)計遵守原則

來源:上海遠慕生物科技有限公司   2023年12月05日 10:13  

熒光定量PCR是實驗室中出鏡率非常高的一種技術(shù)手段。它通過在PCR體系中添加熒光基團來顯示DNA產(chǎn)物的累積情況,從而達到對PCR過程進行實時監(jiān)控的目的。并且可以通過數(shù)據(jù)分析計算出起始模板量,這就是“熒光定量”中“定量”一詞的來源。

熒光定量PCR實驗因為靈敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里,所以在實驗過程中,我們需要注意諸多細節(jié),謹慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了,我怎樣才能做好qPCR實驗,拿到實驗結(jié)果,發(fā)表高分文章,走上人生dian峰呢?

引物設(shè)計的好壞,關(guān)乎著擴增效率的高低、產(chǎn)物特異性的與否。所以正確設(shè)計出引物是qPCR成功的第一步。

首先,我們知道qPCR是特殊的PCR,所以,qPCR的引物設(shè)計要滿足一般PCR引物設(shè)計的原則,見下表。


引物原則.png


除此之外,qPCR引物設(shè)計需要額外注意幾點。

1. 擴增片段長度:

擴增效率隨著擴增子長度減小而增大,建議擴增產(chǎn)物最好在80-200bp的范圍,若產(chǎn)物小于75bp,擴增子很難與引物二聚體區(qū)分開,若產(chǎn)物大于300bp,則會因為酶活降低導(dǎo)致擴增效率降低。如果你的擴增產(chǎn)物因為實驗需求一定要在500-600bp的話,做qPCR實驗時要選用三步法擴增,不要用快速兩步法擴增。

2. 區(qū)分isoform:

對于同一個基因名來說,可能會有不同的isoform。isoform指的是,對于同一個基因,它的mRNA有多種不同剪接方式,這個時候表達出來的的蛋白可能會有不同,所以小伙伴們在設(shè)計實驗的時候,一定要想清楚自己要做的是哪一個isoform。

舉個“栗子”:比如說一個基因有四種不同的isoform,如果大家想要檢測的是四種不同剪接方式轉(zhuǎn)錄本之和,那么設(shè)計引物時就要針對這四個isoform的共有序列設(shè)計。如果只想檢測其中一種isoform,那就要在這個isoform與其他三個isoform的不同序列位置設(shè)計引物。

3. 跨內(nèi)含子設(shè)計引物:

跨越內(nèi)含子設(shè)計引物可以區(qū)分并且規(guī)避基因組DNA污染。設(shè)計引物時需要讓一端或兩端引物跨越內(nèi)含子,以人基因組來說,平均每個基因有8.8個外顯子和7.8個內(nèi)含子,80%的外顯子長度小于200bp,少于10%的內(nèi)含子長度在1100bp以上,不到0.01%的內(nèi)含子長度小于20bp。(Sakharkar MK et al. Distributions of exons and introns in the human genome[J].In Silico Biol. 2004;4(4):387-93.)例如外顯子長度200bp,為了兼顧擴增子長度,我們可以把上游引物設(shè)置在外顯子1和外顯子2的中間,下游引物設(shè)置在外顯子2的位置。




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