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默克生命科學(xué) | DNA和蛋白質(zhì)去磷酸化操作流程
去磷酸化指的是水解去除磷酸(PO43?)基團(tuán)的過(guò)程。在對(duì)蛋白質(zhì)或DNA去磷酸化時(shí)，需要使用酶或水解酶切割酯鍵。例如，磷酸酶可將磷酸單酯水解為磷酸根離子和帶有游離羥基(OH)基團(tuán)的分子，從而去除磷酸基團(tuán)。 默提供各類生命科學(xué)解決方案和服務(wù)
1.利用小牛腸堿性磷酸酶對(duì)DNA進(jìn)行去磷酸化
材料
牛小腸堿性磷酸酶（貨號(hào) P4978）
10X CIP緩沖液（貨號(hào)C3225）
1 M NaCl
0.5 M Tris-HCl，25 °C下pH 7.9
0.1 M MgCl2
0.01 M 二硫蘇糖醇
存儲(chǔ)緩沖液
10 mM Tris-HCl, pH 8.2
50 mM KCl
1 mM MgCl2
0.1 mM ZnCl2
50%甘油
操作流程：
1X CIP緩沖液溶解DNA(0.5 µg DNA/10 µL)。
對(duì)于5’突出的粘末端DNA加入0.1單位/皮摩爾的CIP；對(duì)于3'突出的粘末端或布路姆試劑加入1單位/皮摩爾。
在37℃孵育60分鐘。
苯酚/氯仿2（貨號(hào)P3803 或P2069）提取或凝膠純化DNA。*
乙醇沉淀法恢復(fù)DNA。2
*注意：苯酚提取或凝膠純化后無(wú)需再熱滅活。
熱滅活：對(duì)于牛腸酶，在5毫摩爾/升的乙二胺四乙酸下，加熱至75℃10分鐘，可使95%以上的活性失活。 注意：大腸桿菌的堿性磷酸酶比牛腸酶在高溫下更穩(wěn)定，也更耐熱滅活。
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