檢測原理：

細胞發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA，產(chǎn)生180bp-200bp的DNA片段?；蚪MDNA雙鏈或單鏈斷裂時會出現(xiàn)產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 的催化作用下，與熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而通過光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡或流式細胞儀直接進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法 (Terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL) 。

圖1 TUNEL試劑盒原理示意圖

應(yīng)用范圍：

可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可檢測培養(yǎng)的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。可選擇性的檢測凋亡細胞，而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的DNA鏈斷裂的細胞。

產(chǎn)品優(yōu)勢：

1、應(yīng)用范圍廣：可用于貼壁細胞、懸浮細胞、冷凍切片、石蠟切片；

2、靈敏度高：可以對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色；

3、簡單快速：僅需1.5-3h即可完成；

4、信噪比高：背景染色極低，陽性染色明亮；

5、檢測方法多樣：熒光顯微鏡、流式細胞儀、光學(xué)顯微鏡。

選擇指南：

圖2  TUNEL試劑盒選擇指南

常見問題解答：

1、紅色熒光和綠色熒光的試劑盒與生物素標記的試劑盒有何不同？

最大的區(qū)別在于適配的儀器不同，生物素標記的試劑盒適配光學(xué)顯微鏡，所以在細胞核染色時生物素標記的試劑盒一般適配蘇木素或者甲基綠，熒光素標記的試劑盒一般適配DAPI ，但是熒光素標記的試劑盒實驗時間、短操作簡便、結(jié)果易觀察。

圖3 TUNEL細胞凋亡試劑盒（綠色熒光）

2、陽性對照和陰性對照的作用？

陽性組對照用來驗證本次實驗操作和試劑盒有無問題，陰性組對照為了排除細胞自身凋亡、操作過程、或者染料等原因?qū)е碌姆翘禺愋匀旧?，也用于調(diào)整拍攝曝光強度。一般情況下只需一個陽性對照和一個陰性對照，多個組織也可以設(shè)立多個陰性對照。

3、非特異標記（假陽性）？

1）細胞或組織的核酸酶或聚合酶活性水平較高（如平滑?。珼NA被切斷，易導(dǎo)致假陽性。建議：取出細胞或組織后要立即并充分固定，阻止這些酶的活性，設(shè)置陰性對照有助于判斷；
2）內(nèi)源性過氧化物酶影響，建議：對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織，適當(dāng)延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度；
3）固定液濃度過高或過低，導(dǎo)致組織中心部分固定效果不佳，而使得中心部細胞自溶、DNA鏈出現(xiàn)不規(guī)則斷裂，產(chǎn)生假陽性。建議：推薦使用4%多聚甲醛；
4）TdT酶反應(yīng)時間過長或Tunel反應(yīng)過程中反應(yīng)液發(fā)生蒸發(fā)或滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤。建議：注意控制反應(yīng)時間，并確保TdT酶反應(yīng)液能覆蓋樣品；
5）石蠟、脂肪、血液、體液等都較易與染料結(jié)合，所以組織切片制作時要保持干凈、脫蠟要干凈；
6）有些試劑或細胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時要避開自發(fā)熒光的顏色。

4、沒有染上熒光？

1）固定不充分。固定液選擇4%多聚甲醛，現(xiàn)用現(xiàn)配。不建議使用乙醇，乙醇固定液對組織的滲透力較弱，影響TUNEL標記效率；
2）細胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到達核內(nèi)。細胞與冰凍切片，可用2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蠟切片推薦使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的細胞和組織所需要的通透時間略有不同，時間太長容易脫片，適當(dāng)調(diào)整；
3）延長標記時間至2h，并適當(dāng)增加TdT酶及dUTP的用量；
4）確定實驗對象細胞有凋亡。準備一份DNase I處理的陽性對照，驗證TdT酶反應(yīng)是否正確進行。

圖4 TUNEL及HE染色圖

5、熒光背景高？

1）支原體污染：可以使用支原體染色檢測試劑盒驗證；

2）TdT酶反應(yīng)時間過長，可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作，稀釋后的TdT酶僅供當(dāng)日使用；

3）DAB孵育時間過長，減少DAB染色時間；

4）處于高速分裂和增殖狀態(tài)中的細胞，有時也會出現(xiàn)細胞核中的DNA 斷裂。建議：在非高增殖期取樣檢測；

5）有些試劑或細胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時要避開自發(fā)熒光的顏色；

6）Biotin-X-dUTP的非特異性結(jié)合，在TdT酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-100和1mg/mL BSA的PBS洗三次。

6、標記率低？

1）乙醇、甲醇或甲醛（市面上購買的甲醛大多含有甲醇）固定的樣品標記效率較低（因為在固定時染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中丟失），采用推薦的固定液；
2）固定時間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高，減少固定時間；
3）貼壁細胞如果使用藥物誘導(dǎo)凋亡，會細胞皺縮，貼壁黏附力降低，導(dǎo)致凋亡細胞容易脫落。建議：請注意操作輕緩，防止發(fā)生凋亡的細胞在洗滌時被洗去。后續(xù)整個操作也需要輕緩。

注：文中圖片來自網(wǎng)絡(luò)或參考文獻，僅供學(xué)習(xí)參考用

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