在基因表達調(diào)控的研究中,報告基因廣泛應用,如熒光蛋白、真核抗性和熒光素酶等。在一些臨床醫(yī)學或基礎醫(yī)學文章中,雙熒光素酶結(jié)合驗證實驗部分是多數(shù)機制研究bi備的實驗部分,例如:在通路研究中,尤其涉及到miRNA與功能基因的相互作用時,雙螢光素酶報告基因檢測實驗是bi備的實驗要點。那么你知道到底什么是雙熒光素酶實驗嗎?讓我們一起來看看吧!
螢光素酶(Luciferase)是自然界中能夠產(chǎn)生生物螢光的酶的總稱,其中應用較為廣泛的是螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase)和海腎螢光素酶(Renilla luciferase)。
螢火蟲螢光素酶可以催化螢光素氧化成oxyluciferin,在螢光素氧化的過程中,會發(fā)出生物螢光,呈現(xiàn)黃綠色,海腎螢光素酶可以催化腔腸素氧化成coelenteramide,在腔腸素氧化的過程中,會發(fā)出生物螢光,呈現(xiàn)藍光,通過酶標儀即可測定所發(fā)出的生物螢光。
雙螢光素酶報告基因通常以螢火蟲螢光素酶為報告基因,以海腎螢光素酶為內(nèi)參基因,如此所構成的報告系統(tǒng)有檢測靈敏度高、動態(tài)范圍廣、內(nèi)參平衡等優(yōu)勢,因此在實驗中得到廣泛應用。
常見應用方向:
1. 驗證miRNA同mRNA靶向互作。將靶mRNA的3’UTR序列插入報告基因載體,再共轉(zhuǎn)入該miRNA,檢測螢光素酶活性。
2. 驗證miRNA同circRNA靶向互作。將circRNA序列插入報告基因載體中F-Luc的3’UTR區(qū)域,檢測螢光素酶活性。
3. 驗證miRNA同IncRNA靶向互作。將IncRNA序列插入報告基因載體中F-Luc的3’UTR區(qū)域,檢測螢光素酶活性。
4. 啟動子活性分析。
將啟動子區(qū)域序列進行分段截短,再分別構建入報告基因載體,檢測其啟動子活性。
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