腦卒中俗稱中風(fēng)，是全球成人致殘和死亡的主要原因之一，導(dǎo)致腦卒中的原因主要是動(dòng)脈粥樣硬化、房顫、高血壓、糖尿病等疾病引起的腦血流灌注中斷。腦卒中可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，前者最常見，約占腦卒中的80%。在缺血性卒中期間，谷氨酸的大量釋放可激活NMDARs（N-甲基-D-天冬氨酸受體），誘導(dǎo)鈣離子通過這些離子通道流入神經(jīng)元，使神經(jīng)元超載并破壞其鈣同源穩(wěn)定。盡管科學(xué)家們對(duì)缺血性損傷已經(jīng)有了廣泛的研究，但切實(shí)有效的藥物暫時(shí)還沒有，因此迫切需要確定中風(fēng)的機(jī)制并尋找有效治療缺血性腦卒中的潛在新靶點(diǎn)。

2023年3月14日，上海交通大學(xué)殷善開、史海波及多倫多大學(xué)Wang Lu-Yang團(tuán)隊(duì)在Neuron上在線發(fā)表題為“Bilirubin gates the TRPM2 channel as a direct agonist to exacerbate ischemic brain damage”的研究結(jié)果，提出膽紅素作為內(nèi)源性激動(dòng)劑可以直接阻斷TRPM2通道的開放，進(jìn)而加重缺血性中風(fēng)的腦損傷。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠模型進(jìn)行分子干預(yù)和TRPM2通道封閉，可以起到很好的神經(jīng)保護(hù)作用。

主要研究結(jié)果 (Results) ：

1、中風(fēng)患者和小鼠模型中腦梗塞面積與膽紅素水平的關(guān)系

膽紅素在中風(fēng)中的作用存在爭(zhēng)議，血清膽紅素水平高的患者表現(xiàn)出更嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，而磁共振成像可以準(zhǔn)確確定缺血的位置和大小。對(duì)不同中風(fēng)患者的臨床記錄進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)患有乙肝的中風(fēng)患者的血清總膽紅素 (TB) 水平和直接膽紅素 (DB) 水平比正常組高2至3倍，中風(fēng)顯著增加了TB和DB濃度，表明膽紅素水平升高可能是中風(fēng)的結(jié)果，與梗塞體積呈正相關(guān)。

先前的研究指出，在缺血條件下，細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度升高引起ROS過量產(chǎn)生，從而激活下游信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究者通過使用tMCAO動(dòng)物模型和Trpm2基因型小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討了TRPM2通道在缺血再灌注中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射膽紅素增加了患有tMCAO的Trpm2^+/+小鼠的梗死體積，而Trpm2^-/-小鼠的梗塞體積沒有改變。這表明缺血性損傷可能引起內(nèi)源性膽紅素釋放，而TRPM2通道在其中發(fā)揮一定作用。研究者還觀察到血清和腦脊液中膽紅素水平與梗塞體積顯著相關(guān)，尤其是在Trpm2^+/+小鼠中?？傮w而言，研究得出結(jié)論，中風(fēng)期間的缺血再灌注會(huì)導(dǎo)致膽紅素濃度增加，并且TRPM2通道可能在這一過程中發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。

2、膽紅素通過一種新的門控機(jī)制激活TRPM2通道

研究團(tuán)隊(duì)討論了膽紅素及其結(jié)構(gòu)衍生物對(duì)TRPM2通道的激活機(jī)制。先前的研究指出，內(nèi)源性激動(dòng)劑ADPR通過N端的MHR1/2和C端的NUDT9-H結(jié)構(gòu)域與TRPM2通道的兩個(gè)部位結(jié)合，控制其開放。然而，由于膽紅素具有高度的膜通透性，研究者推測(cè)膽紅素可能通過不同的機(jī)制激活TRPM2通道。

通過在ADPR結(jié)合位和NUDT9-H結(jié)構(gòu)域引入點(diǎn)突變，研究者發(fā)現(xiàn)這些突變體仍然對(duì)膽紅素產(chǎn)生反應(yīng)，盡管激活幅度降低。與此相反，ADPR未能激發(fā)經(jīng)過突變的TRPM2通道。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，截?cái)郚端和C端的ADPR結(jié)合結(jié)構(gòu)域會(huì)阻止ADPR對(duì)TRPM2的激活，但不影響膽紅素的激活。觀察到膽紅素及其衍生物對(duì)TRPM2通道的激活時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，而較小的分子如XAME激活通道的速度更快。通過分子對(duì)接模擬，研究者發(fā)現(xiàn)膽紅素可能與TRPM2通道的特定結(jié)合口袋發(fā)生相互作用。該口袋位于TRPM2通道的鈣結(jié)合部位附近，與D866、K928和D1069等氨基酸殘基形成氫鍵和鹽橋。

通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將這些殘基替換為非極性丙氨酸并不影響ADPR和鈣離子的激活，但阻止了膽紅素的激活。最終，通過分子動(dòng)力學(xué)模擬，研究者比較了膽紅素和XAME在TRPM2通道復(fù)合體中的狀態(tài)轉(zhuǎn)變。結(jié)果表明，XAME的親和力高于膽紅素，這可能解釋了它們?cè)诩せ钏俣群托Ч系牟町?。總體而言，這項(xiàng)研究揭示了膽紅素激活TRPM2通道的機(jī)制，與經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)配體不同。

圖 膽紅素結(jié)合hTRPM2的特異性識(shí)別

3、TRPM2通道中的膽紅素結(jié)合腔是拮抗神經(jīng)毒性的理想藥物部位

TRPM2是中風(fēng)治療的靶點(diǎn)，使用不同結(jié)構(gòu)的阻滯劑，如克霉唑、talM2NX和A23，在動(dòng)物模型的臨床前研究中被認(rèn)為具有神經(jīng)保護(hù)作用。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)新發(fā)表的TRPM2阻斷劑A23與腔形成了高度穩(wěn)定的結(jié)合，為其體外納米分子半最大抑制濃度和體內(nèi)抗缺血性損傷的有效性提供了結(jié)構(gòu)解釋。A23與膽紅素結(jié)合腔高親和力，可有效拮抗膽紅素對(duì)神經(jīng)毒性的作用。

隨后團(tuán)隊(duì)研究了tMCAO聯(lián)合膽紅素注射對(duì)腦梗塞體積增加、血清和腦脊液膽紅素水平升高的影響，并探討了可能的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，tMCAO聯(lián)合膽紅素注射可導(dǎo)致腦梗塞體積增加，血清和腦脊液膽紅素水平升高，且膽紅素主要在神經(jīng)元中產(chǎn)生和釋放。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，缺血和缺氧可直接誘導(dǎo)大腦釋放內(nèi)源性膽紅素，從而加劇中風(fēng)時(shí)的神經(jīng)毒性。

圖 神經(jīng)元NeuN、TRPM2通道、膽綠素還原酶BVR和血紅素加氧1(HO-1)的mIHC結(jié)果圖，表明在中風(fēng)期間，膽紅素主要是在神經(jīng)元中產(chǎn)生和釋放的

4、TRPM2上膽紅素結(jié)合腔的分子擾動(dòng)消除膽紅素誘導(dǎo)的興奮性上調(diào)和神經(jīng)毒性

研究團(tuán)隊(duì)通過各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，得出結(jié)論膽紅素及其結(jié)構(gòu)相似的衍生物能通過與TRPM2通道附近的空腔結(jié)合來激活該通道，其中A23通過競(jìng)爭(zhēng)性拮抗阻斷了這些激動(dòng)劑的結(jié)合。為了驗(yàn)證TRPM2上的空洞介導(dǎo)膽紅素神經(jīng)毒性，研究使用基因敲入小鼠系，將TRPM2中的關(guān)鍵位點(diǎn)替換為丙氨酸。實(shí)驗(yàn)證明這個(gè)位點(diǎn)對(duì)于膽紅素是有效的激動(dòng)劑，而不是鈣/ADPR。D1066A小鼠在電生理實(shí)驗(yàn)中顯示膽紅素不再誘導(dǎo)神經(jīng)元的過度興奮，并在缺血性腦損傷模型中膽紅素的加重效應(yīng)被抑制。這說明TRPM2通道中的結(jié)合腔對(duì)于膽紅素在中風(fēng)中的神經(jīng)毒性發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

結(jié)語(yǔ)：

本研究為開發(fā)針對(duì)TRPM2通道中膽紅素結(jié)合腔的新策略提供了機(jī)械洞察力和原則證據(jù)，以減輕和預(yù)防患者與中風(fēng)和黃疸相關(guān)的腦損傷。

參考文獻(xiàn)：

Liu HW, Gong LN, Lai K, Yu XF, Liu ZQ, Li MX, Yin XL, Liang M, Shi HS, Jiang LH, Yang W, Shi HB, Wang LY, Yin SK. Bilirubin gates the TRPM2 channel as a direct agonist to exacerbate ischemic brain damage. Neuron. 2023 May 17;111(10):1609-1625.e6. doi: 10.1016/j.neuron.2023.02.022. Epub 2023 Mar 14. PMID: 36921602; PMCID: PMC10191619.

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