聚合酶鏈反應(PCR)技術是在體外進行的由引物介導的酶促DNA擴增反應。PCR實驗過程中擴增產物常出現(xiàn)各種問題,以下列舉解決方案供參考:
一、擴增產物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散
(1)酶量過高。減少酶量;酶的質量差,調換另一來源的酶。
(2)dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。
(3)MgCl2濃度過高。可適當降低其用量。
(4)模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng,而基因組DNA則應<200ng。
(5)引物濃度不夠優(yōu)化。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應。
(6)循環(huán)次數過多;增加模板量減少循環(huán)次數至30,縮短退火時間及延伸時間,或改用二種溫度的PCR循環(huán)。
(7)退火溫度過低。
(8)電泳體系有問題:
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大;
②凝膠沒有凝固好;
③瓊脂糖質量差。
(9)若為PCR試劑盒則可能:
①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效;
②試劑盒本身質量有問題,如引物選擇、循環(huán)參數等選擇不當。
(10)降解的陳舊模板擴增也易產生涂布。
二. 擴增產物出現(xiàn)多條帶(雜帶)
(1)引物用量偏大,引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。
(2)循環(huán)的次數過多。適當增加模板的量,減少循環(huán)次數。
(3)酶的用量偏高或酶的質量不好,應降低酶量或調換另一來源的酶。
(4)退火溫度偏低,退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度,減少變性與延伸時間,也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度。
(5)樣品處理不當。
(6)Mg2+濃度偏高,因適當調整Mg2+使用濃度。
(7)若為PCR試劑盒,也可能時試劑盒本身質量有問題。
(8)復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。
(9)反應緩沖液未全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化全并全混勻。
(10)引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。
(11)引物量過多。減少反應體系中引物的用量。
(12)模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng,而基因組DNA則應<200ng。
(13)外源DNA污染。確保操作的潔凈。
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