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利用新型成像細(xì)胞儀直接測定干細(xì)胞的濃度、活力和表型

摘要：間充質(zhì)干細(xì)胞是多能干細(xì)胞的一個子集，可以從中胚層中分離出來。它們具有自我復(fù)制更新和多向分化的特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)上的各種治療中具有很高的潛力。間充質(zhì)干細(xì)胞具有特的免疫表型和免疫調(diào)節(jié)能力。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞移植、組織工程和器移植。除了這些應(yīng)用之外，它們在一系列基礎(chǔ)和臨床研究實(shí)驗(yàn)中作為種子細(xì)胞被用作組織工程的理想工具。到目前為止，還沒有一個廣泛接受的方法和標(biāo)準(zhǔn)來控制間充質(zhì)干細(xì)胞的質(zhì)量。Countstar Rigel可以監(jiān)測這些干細(xì)胞生產(chǎn)和分化過程中的濃度、活力和表型特征（及其變化）。Countstar Rigel還具有在細(xì)胞質(zhì)量監(jiān)測的整個過程中通過久明場和基于熒光的圖像記錄獲得額外形態(tài)信息的優(yōu)勢。Countstar Rigel為干細(xì)胞的質(zhì)量控制提供了一種快速、復(fù)雜和可靠的方法。

材料和方法：

齊念敏教授用AO/PI染色液（上海瑞宇，CF002）對脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞（AdMSCs）進(jìn)行了研究?？贵w：CD29，CD34，CD45，CD56，CD73，CD105，HLADR（BD公司）。

AdMSCs在37℃、5%CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用前用胰蛋酶消化。

按照CD標(biāo)記染色程序作為抗體的手冊。

使用Countstar Rigel檢測CD標(biāo)記：

1.通過設(shè)置PE通道以對PE熒光成像來創(chuàng)建信號顏色應(yīng)用程序。

2.從每個腔室捕獲3個場。

3.成像和初步分析完成后，通過FCS軟件設(shè)置陽性和陰性轉(zhuǎn)染的閾值（對數(shù)門）設(shè)置。

干細(xì)胞的質(zhì)量控制

下圖（圖1）顯示了干細(xì)胞治療的程序。

圖1：干細(xì)胞治療程序

結(jié)果：

測定AdMSCs的濃度、活力、直徑和聚集性。

通過AO/PI測定AdMSCs的活力。通過設(shè)置綠色通道和紅色通道對AO和PI熒光以及亮場進(jìn)行成像，創(chuàng)建了雙色應(yīng)用程序。示例圖像如圖2所示。

圖2:AdMSC運(yùn)輸前和運(yùn)輸后的圖像。A.運(yùn)輸前；示出了代表性圖像。B.運(yùn)輸后；示出了代表性圖像。

與運(yùn)輸前相比，運(yùn)輸后AdMSC的生存能力發(fā)生了巨大變化。運(yùn)輸前的存活率為92%，但運(yùn)輸后降至71%。結(jié)果如圖3所示。

圖3。AdMSC的生存能力結(jié)果（運(yùn)輸前和運(yùn)輸后）

直徑和聚集度也由計(jì)數(shù)星Rigel測定。與運(yùn)輸前相比，運(yùn)輸后AdMSC的直徑發(fā)生了顯著變化。運(yùn)輸前直徑為19µm，但運(yùn)輸后直徑增加到21µm。運(yùn)輸前的總和為20%，但運(yùn)輸后增加到25%。從Countstar Rigel拍攝的圖像來看，AdMSC的表型在運(yùn)輸后發(fā)生了巨大變化。結(jié)果如圖4所示。

圖4：直徑和聚集結(jié)果。A： AdMSC的代表性圖像、AdMSC的表型在運(yùn)輸后發(fā)生了顯著變化。B： 運(yùn)輸前的聚集率為20%，但運(yùn)輸后增加到25%。C： 運(yùn)輸前直徑為19µm，但運(yùn)輸后直徑增加到21µm。

Countstar Rigel測定AdMSCs的免疫表型

用Countstar Rigel法測定AdMSCs的免疫表型，將AdMSCs分別與不同的抗體（CD29、CD34、CD45、CD56、CD73、CD105、HLA-DR）孵育。通過設(shè)置綠色通道對PE熒光和亮場進(jìn)行成像，創(chuàng)建了信號顏色應(yīng)用程序。應(yīng)用亮場圖片參考分割作為掩模來對PE熒光信號進(jìn)行采樣。CD105的結(jié)果如圖所示（圖5）。

圖5:AdMSCs的CD105結(jié)果由Countstar Rigel測定。A： FCS express 5 plus軟件對不同樣本中CD105陽性率的定量分析。B： 高質(zhì)量的圖像提供了額外的形態(tài)學(xué)信息。C： FCS軟件工具通過每個細(xì)胞的縮略圖驗(yàn)證結(jié)果，根據(jù)細(xì)胞不同的蛋白質(zhì)表達(dá)將細(xì)胞分為不同的組。

其他抗體結(jié)果如圖6所示

圖6:A：具有典型紡錘形形態(tài)的ASCs的代表性圖像。通過奧林巴斯顯微鏡拍攝。原始放大倍數(shù)，（10倍）。B： 釕紅染色顯示礦化區(qū)域，證明了ASCs的脂肪分化。通過奧林巴斯顯微鏡拍攝。原始放大倍數(shù)（10倍）。C： ASCs的Countstar FL特征。

摘要：

Countstar FL可以監(jiān)測這些干細(xì)胞生產(chǎn)和分化過程中的濃度、活力和表型特征（及其變化）。FCS express提供了審查每個信號單元、通過圖像驗(yàn)證數(shù)據(jù)的功能。用戶也可以有信心根據(jù)Countstar Rigel的結(jié)果進(jìn)行下一個實(shí)驗(yàn)。Countstar Rigel為干細(xì)胞的質(zhì)量控制提供了一種快速、復(fù)雜和可靠的方法。

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