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間接免疫熒光法-檢測細(xì)胞內(nèi)抗原

來源:上海嶸崴達(dá)實業(yè)有限公司   2012年01月12日 14:16  

                                    間接免疫熒光法-檢測細(xì)胞內(nèi)抗原

       細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測過程與細(xì)胞表面抗原檢測過程基本一致,只是在與一抗孵育前,需要預(yù)先對細(xì)胞用非離子去污劑進(jìn)行透化處理。www.biomart.cn/runwell/index.htm

操作方法www.runwelltac.com
1. 取已固定好的細(xì)胞爬片或甩片或經(jīng)過預(yù)處理的組織切片(石蠟或冰凍切片);
2. 用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的細(xì)胞2min(室溫),有些標(biāo)本可能需要長達(dá)15min,時間視抗原而定;
3. 余下步驟接上述“細(xì)胞表面抗原的檢測-間接免疫熒光法”步驟(2);
 
注意事項
1. 在使用前,一抗二抗均應(yīng)測試其合適的稀釋度。
2. 多聚甲醛的固定是不穩(wěn)定的,標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定后,應(yīng)再用去污劑處理,如果標(biāo)本在水溶液中浸泡的時間過長,則會使交聯(lián)結(jié)構(gòu)解體。因此,應(yīng)避免固定后的標(biāo)本在水溶液中浸泡的時間過長。
3. 信號微弱的解決方法:
① 提高一抗和二抗的濃度以增強(qiáng)敏感性 ,這必須測試各種濃度抗體的滴度;
② 延長一抗和二抗的孵育時間。由于細(xì)胞染色時抗原吸附在固相載體上,抗原抗體結(jié)合時間較在溶液中長。孵育時間可因?qū)嶒炘O(shè)計作適當(dāng)調(diào)整,但少于20min抗體和抗原幾乎不能有效結(jié)合。在以上兩點中,應(yīng)摸索出一個*條件以產(chǎn)生有效信號且保持良好的背景。這就需要反復(fù)試驗,因為每組抗體和抗原的情況會有所不同;
③ 改變檢測方法,用共聚焦顯微鏡觀察,可提高敏感性。
4. 背景不好的解決方法
細(xì)胞樣本進(jìn)行熒光染色時,背景問題主要來自兩個方面,即非特異性染色和特異性交叉反應(yīng)。
① 非特異性吸附:非特異性吸附背景問題的產(chǎn)生與抗原抗體的特異性結(jié)合無關(guān)。即一抗或二抗與樣品相互作用而發(fā)生吸附,而不是與抗原發(fā)生特異性結(jié)合。
*將所有抗體溶液或含蛋白的檢測試劑用100,000′g離心30min以去除蛋白聚合物。
*滴定一抗和所用的檢測試劑,以確定能夠產(chǎn)生合適信號的zui低濃度。
*固定后,用飽和量并不被檢測試劑結(jié)合的非特異性抗體封閉樣品,有效的封閉液包括5%的與標(biāo)記二抗來源相同的同種血清、3%的BSA和3%的脫脂奶粉。
*用上述封閉液稀釋抗體和檢測試劑。
*固定后,在所有的緩沖液及洗滌液中加入2%吐溫-20。
*縮短一抗或標(biāo)記試劑的孵育時間。
*充分洗滌(延長洗滌時間,重復(fù)次數(shù))。
*改變檢測方法。
② 特異性背景:造成特異性背景問題的原因有三種因素,即污染抗體所致假陽性、交叉反應(yīng)和樣品中含有能與Ig結(jié)合的蛋白質(zhì)。
*如用多克隆抗體,應(yīng)滴定抗體(假陽性)。
*如用多克隆抗體,親和純化特異性抗體(假陽性)。
*如用多克隆抗體,用適當(dāng)?shù)谋闻K粉吸收以阻抑假陽性。
*換用其他抗體(交叉反應(yīng)及假陽性)。www.runwelltac.com

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