ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)是一種免疫測定方法,通常用于量化樣品中特定目標(biāo)的水平。常規(guī)用于ELISAs的樣本包括血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清液、細胞裂解液、唾液、組織裂解液和尿液。酶聯(lián)免疫吸附試驗通常在96孔微孔板中進行,微孔板上涂有對相關(guān)分析物的特異性捕獲抗體。在與實驗樣品、標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌贩趸瘯r,目標(biāo)分析物被該抗體捕獲,一個共軛的檢測抗體與目標(biāo)分析物上的不同表位結(jié)合。隨后加入底物溶液,產(chǎn)生一個與分析物結(jié)合量成比例的信號。ELISA的三個主要方法是夾心法、間接法、和競爭法,每種類型的ELISA都有自己的優(yōu)勢和劣勢。
原理及操作步驟如下:
1 、夾心法:
原理:針對抗原分子上2個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物。
夾心法常用于檢測大分子抗原,一般的操作步驟為:
a. 將具有專一性的抗體固著(coating)于塑膠孔盤上,完成后洗去多余抗體
b. 加入待測檢體,檢體中若含有待測的抗原,則其會與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結(jié)
c. 洗去多余待測檢體,加入另一種對抗原專一的一次抗體,與待測抗原進行鍵結(jié)
d. 洗去多余未鍵結(jié)一次抗體,加入帶有酶的二次抗體,與一次抗體鍵結(jié)
e. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體,加入酶底物使酵素呈色,以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果
2、間接法
原理:利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體。
間接法常用于檢測抗體,一般的操作步驟為:
a. 將已知的抗原固著于塑膠孔盤上,完成后洗去多余的抗原。
b. 加入待測檢體,檢體中若含有待測的一次抗體,則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性鍵結(jié)。
c. 洗去多余待測檢體,加入帶有酶的二次抗體,與待測的一次抗體鍵結(jié)。
d. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體,加入酶底物使酶呈色,藉儀器(ELISA reader)測定塑膠盤中的吸光值(OD值),以評估有色終產(chǎn)物的含量即可測量待測抗體的含量。
3、競爭法
原理:將特異性抗體包被于固相載體表面,經(jīng)洗滌后分成兩組:一組加酶標(biāo)記抗原和被測抗原的混合液,另一組只加酶標(biāo)記抗原,經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色,這兩組底物降解量之差,即為所要測定的未知抗原的量。
競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制,一般用于檢測小分子抗原,其操作步驟為:
a. 將具有專一性的抗體固著于塑膠孔盤上,完成后洗去多余抗體
b. 加入待測檢體,使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結(jié)
c. 加入帶有酶的抗原,此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結(jié),由于塑膠孔盤上固著的抗體數(shù)量有限,因此當(dāng)檢體中抗原的量越多,則帶有酶的抗原可鍵結(jié)的固著抗體就越少,亦即,兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗體鍵結(jié),即所謂競爭法之由來。
d. 洗去檢體與帶有酶的抗原,加入酶底物使酶呈色,當(dāng)檢體中抗原量越多,代表塑膠孔盤內(nèi)留下之帶有酶的抗原越少,顯色也就越淺。
e. 當(dāng)需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原,或是不易得到足夠的純化抗體以固著于孔盤上時,一般會考慮使用競爭法ELISA。
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