皖儀科技液相色譜測定藥品中有效成分含量

返魂草為我國長白山地區(qū)的特色資源之一，收載于中國藥典2020年版第四部“成方制劑中本版藥典未收載的藥材和飲片”，為菊科千里光屬植物的干燥全草，包括全葉千里光和麻葉千里光 ,具有清熱化痰、鎮(zhèn)咳平喘功效 ,其主要活性成分是以綠原酸為代表的有機酸類和以金絲桃苷為代表的黃酮類。祛風止痛膠囊是由老鸛草、槲寄生、續(xù)斷等藥材組成的中藥復(fù)方制劑，該藥具有祛風鎮(zhèn)痛、舒筋活血、強壯筋骨的功效,用于四肢麻木、腰膝疼痛、風寒濕痹等癥。處方中續(xù)斷具有補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷、止崩漏、安胎等功效,其有效成分為川續(xù)斷皂苷Ⅵ。

本文采用高效液相色譜法分別對返魂草中綠原酸、金絲桃苷含量以及祛風止痛丸中續(xù)斷的有效成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量進行測定,均取得滿意效果。

1 實驗方法

1.1 儀器配置

          表1. 高效液相色譜系統(tǒng)配置清單

1.2 試劑及實驗材料

1.2.1 返魂草

乙腈：色譜純；

甲醇：色譜純；

綠原酸（標準品）：(100μg/mL in Methanol)；

金絲桃苷（標準品）：(98.0%)；

一次性注射器（0.5-2mL）；

微孔濾膜（0.45μm）；

1.2.2 祛風止痛丸

乙腈：色譜純；

甲醇：色譜純；

正丁醇：分析純；

氨水：優(yōu)級純；

川續(xù)斷皂苷Ⅵ（標準品）：(98.0%）；

1.3 測試條件

1.3.1 返魂草

色譜柱：C18 5μm, 4.6×250mm；

柱溫：35℃；

流速：1mL/min；

檢測波長：350nm；

進樣方式及進樣量：自動部分10μL進樣；

流動相：A：乙腈 B：0.2%甲醇溶液；

        表2. 返魂草流動相梯度洗脫條件

1.3.2 祛風止痛丸

色譜柱：C18 5μm, 4.6×250mm；

柱溫：35℃；

流速：1mL/min；

檢測波長：212nm；

進樣方式及進樣量：自動部分10μL進樣；

流動相：乙腈-水=30:70；

1.4 溶液配制

1.4.1 返魂草

1.4.1.1 標準儲備液

①精確量取標準品綠原酸（100μg/mL）600μl，加甲醇制成每1mL含綠原酸60μg的綠原酸標準儲備液。

②精密稱定標準品金絲桃苷（98.0%）0.0042g，用甲醇定容至100mL容量瓶中制成40μg/mL的金絲桃苷標準儲備液。

1.4.1.2 混合標準工作液

分別量取綠原酸標準儲備液、金絲桃苷標準儲備液各500uL，混勻，即可配制成每1mL含綠原酸30μg、金絲桃苷20μg的混合標準工作液。

1.4.1.3 供試品溶液

取本品粉末（過四號篩）0.2506g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液20mL,密塞，稱定重量，超聲處理（250W，頻率40KHz）60分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4.2 祛風止痛丸

1.4.2.1 水飽和的正丁醇

在分液漏斗里面倒入適量的水和正丁醇，振搖提取數(shù)分鐘，放置分層后，先將下層的水（水的密度較正丁醇大）從漏斗中緩慢放出，余下者即為水飽和正丁醇。

1.4.2.2 氨試液

取濃氨溶液60mL，加水使成150mL，即得。

1.4.2.3 正丁醇飽和的水

在水中加入足量的正丁醇，混合均勻，然后靜置分層，取水使用。

1.4.2.4 標準品溶液

取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品0.0052g，精密稱定，置于25mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即制成每1mL含0.2mg的溶液。

1.4.2.5 供試品溶液

取祛風止痛丸適量，研細，取1.9998g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL,密塞，稱定重量，超聲處理（250W，頻率50KHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25mL，蒸干，殘渣加水25mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次（50mL，30mL,30mL），合并正丁醇提取液，用氨試液100mL洗滌，再用正丁醇飽和的水100mL洗滌，取正丁醇液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至25mL用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 綠原酸、金絲桃苷標準品檢測

         圖1. 綠原酸、金絲桃苷標準品色譜圖

           表3. 綠原酸標準品色譜參數(shù)

          表4. 金絲桃苷標準品色譜參數(shù)

2.2返魂草樣品檢測

               圖2 返魂草色譜圖

           表5. 返魂草綠原酸色譜參數(shù)

           表6. 返魂草金絲桃苷色譜參數(shù)

說明：據(jù)返魂草色譜圖可見樣品綠原酸、金絲桃苷分離效果、重復(fù)性較好，根據(jù)外標法計算返魂草中含綠原酸（C16H18O9）為0.25%，含金絲桃苷（C21H20O12）為0.127%。

2.3川續(xù)斷皂苷Ⅵ標準品檢測

         圖3. 川續(xù)斷皂苷Ⅵ標準品色譜圖

  表7. 川續(xù)斷皂苷Ⅵ標準品色譜參數(shù)2.4祛風止痛丸樣品檢測

            圖4. 祛風止痛丸色譜圖

            表8. 祛風止痛丸色譜參數(shù)

說明：據(jù)色譜圖可見祛風止痛丸樣品、川續(xù)斷皂苷標準品的重復(fù)性較好，根據(jù)外標法計算，以川續(xù)斷皂苷Ⅵ（C47H76O18）計，祛風止痛丸中每1g含續(xù)斷6.35mg。

3 結(jié)論

據(jù)吉林省中藥材標準DBY-22-JLYC-001-2017，返魂草樣品含量測定按干燥品計算，含綠原酸（C16H18O9）不得少于0.10%，金絲桃苷（C21H20O12）不得少于0.050%。使用皖儀科技高效液相色譜儀LC3200系列配置紫外-可見光檢測器測得返魂草樣品中含綠原酸（C16H18O9）為0.25%，含金絲桃苷（C21H20O12）為0.127%，返魂草樣品中綠原酸（C16H18O9）的定性RSD（%）為0.355%，定量RSD（%）為0.491%。樣品中金絲桃苷（C21H20O12）的定性RSD（%）為0.399%，定量RSD（%）為0.403%，均符合標準。

據(jù)《中國藥典》，祛風止痛丸樣品含量測定按每1g含續(xù)斷以川續(xù)斷皂苷VI（C47H76O18）計，不得少于4.30mg。使用皖儀科技高效液相色譜儀LC3200系列配置紫外-可見光檢測器測得祛風止痛丸樣品中以川續(xù)斷皂苷Ⅵ（C47H76O18）計每1g含續(xù)斷6.35mg，祛風止痛丸樣品中川續(xù)斷皂苷VI（C47H76O18）的定性RSD（%）為0.331%，定量RSD（%）為0.663%，符合標準。

實驗結(jié)果表明，使用皖儀科技高效液相色譜儀LC3200系列配置紫外-可見光檢測器測定返魂草和祛風止痛丸中有效成分含量，分離效果和重復(fù)性較好，能夠很好地滿足《中國藥典》和吉林省中藥材標準DBY-22-JLYC-001-2017的測試要求。