用低濃度PEG將IC沉淀,沉淀物中加入補體,以溶血反應(yīng)檢測補體消耗率。
(一)試劑
1.熱聚合人ISC:制備方法同PEG沉淀試驗。
2.硼酸緩沖鹽水(朋S) 含硼酸0.1mol/L,硼砂25mmol/L,NaCl 75mmol/L,調(diào)整為pH8.4
3.PEG 用BBS將PEG配成12.5%和2.5%。
4.0.2mol/L EDTA-Na2用1mol/L NaOH調(diào)整為pH7.2。
5.5XVB保存液 NaCl 85,0g,巴比妥5.75g,巴比妥鈉3.75g,加蒸餾水約1 500ral,加熱溶解后補加蒸餾水至2000mL。
6.GVB2+5×VB保存液400mL,0.03mol/LCaCl210mL,0.1mol/L MgCl2 10mL,2%明膠lOOmL,補加蒸餾水至2000mL,pH7.5。
7.致敏綿羊紅細胞(SRBC) 2%SRBC懸液加等量1:1 000溶血素,37t水浴l0min,用GVB2+將致敏SRBC配成1.5×108/mL。
8.人補體與健康人對照血清 選用總補體溶血活性正常的健康人血清數(shù)份混合,作為補體來源。自3名健康人各取血清50mL,各按lmLl份分裝,—70℃凍存,每次取3份血清作為對照。
(二)操作步驟
1.待測血清0.3mL,加0.2mol/L EDTA-Na2和BBS各50uL,充分混勻后加入12。5%PEG 0.1mL,混勻,置4℃ 90rain。
2.4℃ 1 700r/rain離心10min,棄上清,沉淀物用2.5%PEG洗1次,用玻璃棒攪拌,再于4℃ 1 700r/min離心15min,棄上清,管口余水用濾紙吸除。
3.加入37℃ 30min預(yù)溫的GV鏟’30uL,待沉淀溶解后,加入混合人補體10uL(用微量加樣器準(zhǔn)確加入)?;靹?,置37℃,使補體與IC充分反應(yīng)。
4.加入1.5X108/mL致敏SRBCl.0mL,37℃水浴振蕩60rain。取出后立即加人4℃冷生理鹽水6.5mL,離心,吸取上清液于414mn波長測吸光度。
5.每批試驗以熱聚合人IgG 5、10、25、50、lOOug/mL制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成相當(dāng)于熱聚合人IgG的ug/mL。
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