ELISA又稱酶聯(lián)免疫吸附測定，是定量檢測體液中各種靶標蛋白含量的常用方法。其呈色反應(yīng)可進行定性或定量分析，利用HRP酶催化TMB，反應(yīng)產(chǎn)生藍色亞胺溶液，加入終止液后，使藍色陽離子轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌。除了常見的藍色和黃色，ELISA實驗過程中，也會出現(xiàn)一些不同尋常的多樣色彩。

一、墨綠色 / 深藍色

例：加入底物溶液孵育后，酶標板孔溶液變成墨綠色或深藍色。

在正常的ELISA實驗中，加入底物溶液孵育后，標曲前四孔出現(xiàn)明顯藍色梯度，即可終止反應(yīng)。但是，當(dāng)孵育的HRP酶結(jié)合物工作液濃度過高，或樣本濃度遠高于檢測范圍時，標曲最高1-2個梯度孔或樣本孔可能會呈現(xiàn)墨綠色或深藍色。

墨綠色樣本終止反應(yīng)后，在450nm波長下讀取的OD值可能會比實際要低；深藍色標曲會由于梯度OD值過于接近，無法擬合得到有效標曲并準確計算樣本濃度。

建議：

（1）嚴格控制每一步的孵育溫度和時間，按照說明書要求制備HRP酶結(jié)合物工作液；

（2）在顯色階段，通過前四孔出現(xiàn)明顯藍色梯度來控制顯色時間；

（3）濃度過高的樣本需要稀釋到試劑盒檢測范圍內(nèi)，再進行測定。

二、黃色

例：終止反應(yīng)后，整板變成黃色。

可能原因：

1 競爭法按照夾心法操作：兩者原理不同，操作步驟不同，請注意區(qū)分。

2 洗滌不當(dāng)：甩板時離廢液桶太近，導(dǎo)致液體反濺；甩板不干脆，導(dǎo)致液體殘留或流入其他孔；洗滌時每孔注入的洗液不夠，或洗滌次數(shù)不夠；液體過多溢出污染；浸泡時間過短；

3 顯色劑保存不當(dāng)，或孵育時未避光，造成非特異性顯色；

4 孵育溫度過高，或孵育時間過長；

5 不同試劑盒組分混用或替代，產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)或非特異性吸附，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

三、標曲正常，樣本孔全黃

讀值計算后，發(fā)現(xiàn)標曲擬合效果良好，但樣本OD超過標曲最大OD，表明樣本還需要稀釋哦。

四、 黑色

例：加入終止液后，酶標板孔中液體變黑，或產(chǎn)生黑色沉淀。

可能原因：

1、HRP酶濃度過高：準備HRP酶工作液時，保證計算和配制體積準確，按照說明書中的洗滌體積、時間、次數(shù)進行洗板；

2、樣本中指標濃度過高，樣本還需要稀釋；

3、終止液中硫酸濃度過高或變質(zhì)：終止液是1M H2SO4，混用過高濃度的硫酸可能導(dǎo)致炭化反應(yīng)。