ELISA又稱酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，是定量檢測(cè)體液中各種靶標(biāo)蛋白含量的常用方法。其呈色反應(yīng)可進(jìn)行定性或定量分析，利用HRP酶催化TMB，反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色亞胺溶液，加入終止液后，使藍(lán)色陽(yáng)離子轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌。除了常見(jiàn)的藍(lán)色和黃色，ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，也會(huì)出現(xiàn)一些不同尋常的多樣色彩。

一、墨綠色 / 深藍(lán)色

例：加入底物溶液孵育后，酶標(biāo)板孔溶液變成墨綠色或深藍(lán)色。

在正常的ELISA實(shí)驗(yàn)中，加入底物溶液孵育后，標(biāo)曲前四孔出現(xiàn)明顯藍(lán)色梯度，即可終止反應(yīng)。但是，當(dāng)孵育的HRP酶結(jié)合物工作液濃度過(guò)高，或樣本濃度遠(yuǎn)高于檢測(cè)范圍時(shí)，標(biāo)曲最高1-2個(gè)梯度孔或樣本孔可能會(huì)呈現(xiàn)墨綠色或深藍(lán)色。

墨綠色樣本終止反應(yīng)后，在450nm波長(zhǎng)下讀取的OD值可能會(huì)比實(shí)際要低；深藍(lán)色標(biāo)曲會(huì)由于梯度OD值過(guò)于接近，無(wú)法擬合得到有效標(biāo)曲并準(zhǔn)確計(jì)算樣本濃度。

建議：

（1）嚴(yán)格控制每一步的孵育溫度和時(shí)間，按照說(shuō)明書(shū)要求制備HRP酶結(jié)合物工作液；

（2）在顯色階段，通過(guò)前四孔出現(xiàn)明顯藍(lán)色梯度來(lái)控制顯色時(shí)間；

（3）濃度過(guò)高的樣本需要稀釋到試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)，再進(jìn)行測(cè)定。

二、黃色

例：終止反應(yīng)后，整板變成黃色。

可能原因：

1 競(jìng)爭(zhēng)法按照夾心法操作：兩者原理不同，操作步驟不同，請(qǐng)注意區(qū)分。

2 洗滌不當(dāng)：甩板時(shí)離廢液桶太近，導(dǎo)致液體反濺；甩板不干脆，導(dǎo)致液體殘留或流入其他孔；洗滌時(shí)每孔注入的洗液不夠，或洗滌次數(shù)不夠；液體過(guò)多溢出污染；浸泡時(shí)間過(guò)短；

3 顯色劑保存不當(dāng)，或孵育時(shí)未避光，造成非特異性顯色；

4 孵育溫度過(guò)高，或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；

5 不同試劑盒組分混用或替代，產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)或非特異性吸附，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

三、標(biāo)曲正常，樣本孔全黃

讀值計(jì)算后，發(fā)現(xiàn)標(biāo)曲擬合效果良好，但樣本OD超過(guò)標(biāo)曲最大OD，表明樣本還需要稀釋哦。

四、 黑色

例：加入終止液后，酶標(biāo)板孔中液體變黑，或產(chǎn)生黑色沉淀。

可能原因：

1、HRP酶濃度過(guò)高：準(zhǔn)備HRP酶工作液時(shí)，保證計(jì)算和配制體積準(zhǔn)確，按照說(shuō)明書(shū)中的洗滌體積、時(shí)間、次數(shù)進(jìn)行洗板；

2、樣本中指標(biāo)濃度過(guò)高，樣本還需要稀釋；

3、終止液中硫酸濃度過(guò)高或變質(zhì)：終止液是1M H2SO4，混用過(guò)高濃度的硫酸可能導(dǎo)致炭化反應(yīng)。