DNA甲基化修飾在維持正常細(xì)胞功能、基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、遺傳印記、胚胎發(fā)育、及腫瘤和疾病的發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵作用。5mC可以導(dǎo)致基因沉默或基因表達(dá)水平降低，而5hmC則會(huì)導(dǎo)致基因激活或基因表達(dá)水平增高，研究表明腫瘤抑癌基因的過(guò)甲基化或原癌基因的低甲基化在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。因此，分析基因組的甲基化水平具有重要的臨床意義。

隨著分子檢測(cè)的不斷發(fā)展，甲基化qPCR檢測(cè)以及甲基化NGS檢測(cè)已成為非常普及的檢測(cè)技術(shù)，這兩種技術(shù)的必經(jīng)之路就是甲基化轉(zhuǎn)化，甲基化轉(zhuǎn)化從方法學(xué)上可分為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和酶法轉(zhuǎn)化，近幾年，基于DNA甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒陸續(xù)獲批面世。NMPA批準(zhǔn)的甲基化檢測(cè)試劑盒大部分為熒光PCR法，主要原因在于熒光PCR法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需在PCR后電泳，且具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)。這些甲基化檢測(cè)試劑采用的轉(zhuǎn)化方法為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化法，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化成為DNA甲基化檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化有很多局限性，例如過(guò)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化時(shí)間、嚴(yán)重的DNA損傷、被高估的5mC水平、C-U轉(zhuǎn)化不全等。

圖1.亞硫酸氫鹽催化C轉(zhuǎn)化為U的化學(xué)反應(yīng)概要

2024年1月2日，芝加哥大學(xué)何川教授團(tuán)隊(duì)在Nature Biotechnology上在線發(fā)表了題為Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5?methylcytosine in DNA and RNA的研究論文，該研究提出并開發(fā)了對(duì)DNA和RNA上的5-甲基胞嘧啶修飾進(jìn)行快速，準(zhǔn)確檢測(cè)的測(cè)序方法，簡(jiǎn)稱為UBS-seq。該技術(shù)比現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程加速20-30倍，同時(shí)明顯的降低了DNA損傷，以及C-U轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的背景干擾。

圖2.UBS-seq法在微量樣本中應(yīng)用，傳統(tǒng)BS轉(zhuǎn)化相比有更低的背景噪音

翌圣生物的Hieff® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit便是基于此技術(shù)開發(fā)優(yōu)化而成，可以在98°C 5min條件下可完成＞99.5%的胞嘧啶轉(zhuǎn)化，并且極大的降低了DNA損傷，更好的保證了DNA片段的完整性。

圖3.Superfast DNA Methylation Bisulfite的技術(shù)原理及優(yōu)勢(shì)

Hieff® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit（12225ES）將DNA變性與亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化融合為一步，5分鐘內(nèi)即可完成轉(zhuǎn)化，約30 min可完成BS轉(zhuǎn)化全流程。采用柱內(nèi)脫硫技術(shù)，使操作流程更為簡(jiǎn)單；可以滿足100 pg-2 μg樣品的轉(zhuǎn)化；未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的轉(zhuǎn)化率≥99%；轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物適用于PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序等下游應(yīng)用。

圖4.Superfast BS轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)流程

使用12225與競(jìng)品A和競(jìng)品B轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行頭對(duì)頭對(duì)比，轉(zhuǎn)化樣本為200 ng和2 μg的FFPE DNA，F(xiàn)FPE DNA中參入1% λ DNA，轉(zhuǎn)化后的樣本采用甲基化單鏈DNA建庫(kù)（12221ES），如圖5所示：12225對(duì)不同投入量的FFPE DNA中 λ DNA C的轉(zhuǎn)化率＞99.5%。

使用12225與競(jìng)品B和競(jìng)品C轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行頭對(duì)頭對(duì)比，300 ng樣本為不含甲基化 λ DNA，800ng樣本為人基因組DNA，轉(zhuǎn)化后采用Qubit ssDNA定量，洗脫體積均為30 μL，轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物采用甲基化轉(zhuǎn)化特異性引物探針PCR，片段大小為286bp，擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳，如圖6所示：12225的樣本回收率優(yōu)于競(jìng)品B和競(jìng)品C，且轉(zhuǎn)化后的甲基化特異性引物擴(kuò)增效果 優(yōu)。

圖6.12225和競(jìng)品的回收率

使用12225和競(jìng)品A轉(zhuǎn)化試劑盒分別對(duì)gDNA樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后使用甲基化單鏈建庫(kù)試劑盒（12221ES）建庫(kù)，文庫(kù)產(chǎn)量和質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)如圖6所示：12225和競(jìng)品A轉(zhuǎn)化后相同的文庫(kù)pooling測(cè)序，12225下機(jī)數(shù)據(jù)量更多，ontarget_ratio(%)更高，Dup(%)更低。

敲重點(diǎn)：試用回饋數(shù)據(jù)有獎(jiǎng)，名額有限，先到先得！詳情咨詢當(dāng)?shù)貥I(yè)務(wù)員。