考馬斯亮藍(lán)染色液正確的染色步驟
描述:
常規(guī)考馬斯亮藍(lán)SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)染色是實(shí)驗(yàn)室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度高,但所需試劑復(fù)雜并且有毒有害,操作步驟繁瑣,難以控制獲得好的染色效果。
考馬斯亮藍(lán)有G-250和R-250兩種。
游離狀態(tài)的考馬斯亮藍(lán)G250 在酸性溶液中呈藍(lán)偏綠色,與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈藍(lán)色,蛋白質(zhì)含量與顏色的深淺成正比,經(jīng)595nm 測(cè)定,可作出蛋白質(zhì)含量與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。R-250呈藍(lán)色,有輕微紅色。
染色步驟:
1. 此染色液即為工作液,使用時(shí)直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍(lán)染色液覆蓋凝膠,并緩慢搖動(dòng)2h;也可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整時(shí)間。
2. 傾去染色液,用脫色液沖洗凝膠。
3. 以脫色液覆蓋凝膠,緩慢搖動(dòng)2h,(或者根據(jù)時(shí)間情況調(diào)整脫色時(shí)間)傾去脫色液,再加入新脫色液進(jìn)行脫色,直至獲得清晰的藍(lán)色的條帶和干凈的背景(通常此過(guò)程需要2~4h,也可脫色過(guò)夜至清晰的藍(lán)色的條帶和干凈的背景)。
4. 對(duì)凝膠進(jìn)行分析和照相,凝膠可放置在7%的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置(P2000)對(duì)凝膠進(jìn)行處理后保存。
① 上樣緩沖液中包括甘油,溴酚藍(lán),SDS等,甘油主要作用是防止樣品漂浮出點(diǎn)樣孔,溴酚藍(lán)作為電泳指示劑,用來(lái)觀察電泳進(jìn)度,SDS用于一些核酸結(jié)合蛋白的變性解離.
②染色液與凝膠中核酸結(jié)合,以便于在紫外光下顯示核酸條帶.
loading buffer 的中文名字叫上樣緩沖液,6kb的緩沖液中可以顯示兩條帶,前面的紫藍(lán)色的條帶是溴酚藍(lán),在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中,溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。
后面的藍(lán)色條帶是二甲苯氰,它在1%和1.4%瓊脂糖中電泳時(shí),其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA大致相似。而對(duì)于PAGE膠他們的遷移速率也分別不同。
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