乳腺癌（BC）是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，在所有 BC 亞型中，激素受體陽(yáng)性乳腺癌（HR+ BRCA）是最多的。骨髓是乳腺癌最易發(fā)生轉(zhuǎn)移的部位，腫瘤細(xì)胞的骨髓微轉(zhuǎn)移（BMM）是預(yù)后不良的惡性腫瘤的顯著特征。淋巴結(jié)狀態(tài)與 BMM 顯著相關(guān)，并可能作為后續(xù)轉(zhuǎn)移的“孵化器”。因此，探索淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制對(duì)于確定有效和新穎的 BC 治療策略至關(guān)重要。

BPIFB1（殺菌/滲透增強(qiáng)折疊家族蛋白B1），也稱為 LPLUNC1，是 BPI/PLUNC 超家族的成員，可特異性結(jié)合革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的 LPS。BPIFB1 在鼻咽癌、肺癌、胃癌等腫瘤組織中異常表達(dá)，調(diào)節(jié)慢性感染和炎癥，表明其可能在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是主要的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞類型之一，其中，M2型巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)血管生成、淋巴管生成以及促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的功能。研究表明，TLR4 信號(hào)通路的抑制促進(jìn)了 M2巨噬細(xì)胞極化，而 BPIFB1 對(duì)該通路表現(xiàn)出抑制作用。因此，探索 BPIFB1 是否通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化來(lái)影響 BC 具有重要意義。

鑒于此，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科及大慶油田總醫(yī)院普外科課題組的一項(xiàng)聯(lián)合研究曾探討發(fā)現(xiàn)，BPIFB1 在 HR+ BRCA 中異常高表達(dá)，尤其是在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中。此外，其高表達(dá)與 BC 的不良預(yù)后顯著相關(guān)，尤其是在管腔A 亞型中。從機(jī)制上講，BPIFB1 在體外和體內(nèi)均作為 M2巨噬細(xì)胞極化的激活劑并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。研究成果發(fā)表在 Cancer Science 期刊題為“BPIFB1 promotes metastasis of hormone receptor-positive breast cancer via inducing macrophage M2-like polarization”。

首先，研究人員收集了癌癥基因組圖譜（TCGA）的 RNA 測(cè)序表達(dá)譜和臨床信息，并將樣本分為無(wú)局部淋巴結(jié)（N0）轉(zhuǎn)移（NMT）患者樣本和N1-3淋巴結(jié)狀態(tài)（LMT）患者樣本兩組進(jìn)行基因差異分析，其中，BPIFB1，尚未在 BC 中報(bào)道，被選為進(jìn)一步調(diào)查的候選靶點(diǎn)。

然后評(píng)估了 BPIFB1 在臨床乳腺腫瘤樣本中表達(dá)的臨床意義。數(shù)據(jù)顯示，在 HR+ BRCA 中，LMT 組的 BPIFB1 的表達(dá)明顯高于 NMT 組。此外，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，BPIFB1 在癌癥組織中，特別是在管腔A型乳腺癌中顯著升高。將培養(yǎng)的人乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞使用雌激素進(jìn)行刺激，發(fā)現(xiàn)雌激素暴露的腫瘤細(xì)胞 BPIFB1 表達(dá)增加，研究人員推測(cè) BC 中 BPIFB1 的表達(dá)可能受雌激素信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。同時(shí)，與 BPIFB1 陰性組相比，BPIFB1 陽(yáng)性組的患者趨向于更高的N期（20/33），驗(yàn)證了 BPIFB1 表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明，BPIFB1 在 HR+ BRCA 中上調(diào)，這與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移趨勢(shì)呈正相關(guān)。

進(jìn)一步地，通過(guò)生存數(shù)據(jù)以及 TCGA 和 METABRIC 提供的臨床注釋進(jìn)行 KM 分析，結(jié)果顯示，BPIFB1 的高表達(dá)與管腔A型乳腺癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)，但在管腔B、HER2 陽(yáng)性或三陰性亞型中則不相關(guān)。

接下來(lái)，研究人員進(jìn)行了富集分析，以探索 BPIFB1 在 HR+ BRCA 中的潛在作用。通過(guò) GSEA 鑒定富集通路，結(jié)果表明，BPIFB1 可能與內(nèi)分泌抵抗和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)，這與 BC 轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

此外，對(duì)生物過(guò)程（GO-BP）、分子功能（GO-MF）和細(xì)胞成分（GO-CC）進(jìn)行了獨(dú)立測(cè)試，表明 BPIFB1 相關(guān)基因集在多種免疫相關(guān)通路中顯著富集（圖1 A）。KEGG 通路富集分析結(jié)果表明，BPIFB1 相關(guān)基因在雌激素信號(hào)通路中顯著富集（圖1 B），這再次證實(shí)了上述結(jié)果。基于此，研究人員假設(shè) BPIFB1 可能在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。

為了進(jìn)一步研究 BPIFB1 是否能夠調(diào)節(jié)TME中的免疫細(xì)胞，研究人員將 HR+ BRCA 樣本根據(jù) BPIFB1 的中位表達(dá)分為 BHE 組（BPIFB1高表達(dá)）和 BLE 組（BPIFB1低表達(dá)）分析了其與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M2巨噬細(xì)胞、初始B細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、漿細(xì)胞、記憶B細(xì)胞和活化的NK細(xì)胞在 BHE 亞組中更豐富，而靜息NK細(xì)胞在 BLE 亞組中更豐富。然而，BPIFB1 與四個(gè)已知的 M2 極化調(diào)節(jié)因子相關(guān)基因的 Spearman 相關(guān)性沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？偟膩?lái)說(shuō)，從數(shù)據(jù)比較中得出的觀察結(jié)果是，BPIFB1 可能對(duì)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的極化發(fā)揮獨(dú)立作用。

圖1    預(yù)測(cè)BPIFB1在激素受體陽(yáng)性乳腺癌中的潛在功能和機(jī)制。（A、B）BPIFB1 相關(guān)基因的 GO 和 KEGG 富集。

腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞可以被癌細(xì)胞影響。BPIFB1 水平在 T47D 和 MCF-7 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，研究人員還使用 qPCR 分析來(lái)證實(shí)其有效性（圖2 A）。最后，為了探索癌細(xì)胞來(lái)源的 BPIFB1 是否可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞 M2 活化，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了 BC 腫瘤細(xì)胞/THP1 共培養(yǎng)系統(tǒng)，檢測(cè)了 THP-1 細(xì)胞的 M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（CD206、CD163）。ELISA 測(cè)定法證實(shí)，與對(duì)照組相比，共培養(yǎng)系統(tǒng)上清液中的可溶性 BPIFB1 顯著增加（圖2 B）。共培養(yǎng)后，通過(guò)刺激 THP-1 中的 BPIFB1，CD206 和 CD163 的表達(dá)顯著增加 （圖2 C）。與上述分析結(jié)果一致，研究認(rèn)為，癌細(xì)胞衍生的 BPIFB1 可能會(huì)促進(jìn) M2巨噬細(xì)胞極化。

然后，為了研究 BPIFB1 對(duì) THP1 細(xì)胞的腫瘤調(diào)節(jié)作用，在體外進(jìn)行了功能研究。與對(duì)照組相比，BPIFB1 的過(guò)表達(dá)顯著增加了與 THP1 共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖2 D）。有趣的是，共培養(yǎng)系統(tǒng)中 THP-1 的缺失抑制了 BPIFB1 過(guò)表達(dá)對(duì) MCF-7 細(xì)胞遷移和侵襲的影響，這表明巨噬細(xì)胞在 BPIFB1 對(duì) BC 的表型調(diào)控中具有重要意義。

為了進(jìn)一步證實(shí)上述在體內(nèi)的發(fā)現(xiàn)，建立了異種移植小鼠模型（圖2 E），觀察到 BPIFB1 在 BC 腫瘤細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)顯著增加了肺轉(zhuǎn)移模型中的異種移植腫瘤大小（圖2 F）。與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似，注射 BPIFB1 過(guò)表達(dá) BC 細(xì)胞的小鼠表現(xiàn)出更多的肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)（圖2 G）。

此外，為了進(jìn)一步驗(yàn)證 BPIFB1 是否也通過(guò)刺激 M2巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)體內(nèi)腫瘤進(jìn)展，采用 IHC 染色檢測(cè)組織中 CD206 和 CD163 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物在注射 BPIFB1 過(guò)表達(dá) BC 細(xì)胞的小鼠模型的組織中表達(dá)水平較高（圖2 H）。一致地，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，BPIFB1 也能調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7 的極化，從而影響腫瘤細(xì)胞的表型。這些數(shù)據(jù)共同證實(shí)了，BPIFB1 在體外和體內(nèi)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，并可能在增強(qiáng) M2巨噬細(xì)胞極化方面發(fā)揮作用。

圖2    BPIFB1 通過(guò)在體外和體內(nèi)刺激 M2 巨噬細(xì)胞極化來(lái)促進(jìn)激素受體陽(yáng)性乳腺癌的進(jìn)展。

（A）qPCR分析測(cè)定BPIFB1 mRNA表達(dá)。（B）ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清液中可溶性BPIFB1蛋白表達(dá)水平。（C）qPCR檢測(cè)THP1中CD206和CD163的表達(dá)。（D）Transwell遷移和侵襲測(cè)定。（E）尾靜脈注射T47D腫瘤細(xì)胞構(gòu)建小鼠肺轉(zhuǎn)移模型。（F）小鼠模型用于分析腫瘤的生長(zhǎng)。（G）轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)的定量用于表征腫瘤轉(zhuǎn)移。（H）移植腫瘤中CD206 和 CD163的表達(dá)。

綜上所述，該研究通過(guò)生物信息學(xué)分析確定了與 HR+ BRCA 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)的新靶點(diǎn) BPIFB1。BPIFB1 與各種轉(zhuǎn)移相關(guān)的臨床特征相關(guān)，并預(yù)示 HR+ BRCA 的不良預(yù)后。從機(jī)制上講，它促進(jìn)了 M2巨噬細(xì)胞極化，從而增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí) BPIFB1 在體內(nèi)促進(jìn)了激素受體陽(yáng)性 BC 的轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果為腫瘤免疫和 BPIFB1 的機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。

參考文獻(xiàn)：Hu A, Liu Y, Zhang H, Wang T, Zhang J, Cheng W, Yu T, Duan Y, Feng J, Chen Z, Ding Y, Li Y, Li M, Rong Z, Shang Y, Shakila SS, Zou Y, Ma F, Guo B. BPIFB1 promotes metastasis of hormone receptor-positive breast cancer via inducing macrophage M2-like polarization. Cancer Sci. 2023 Nov;114(11):4157-4171. doi: 10.1111/cas.15957. Epub 2023 Sep 13. PMID: 37702269; PMCID: PMC10637056.

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