IHC實(shí)驗(yàn)是科研人bi備的實(shí)驗(yàn)技能之一，然而IHC實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜，而且經(jīng)常出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，常常讓人頭疼。為此特別給大家整理了一份IHC實(shí)驗(yàn)詳解，原理，步驟，注意事項(xiàng)及操作視頻一網(wǎng)打盡，想做IHC實(shí)驗(yàn)只看這篇就夠了（分為上下兩篇哦）。

IHC實(shí)驗(yàn)原理

免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)：利用抗原－抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色以確定細(xì)胞內(nèi)抗原，并對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。和WB實(shí)驗(yàn)相比，IHC實(shí)驗(yàn)可以更為直觀(guān)的展現(xiàn)待測(cè)蛋白的表達(dá)量和位置，也常用于病理診斷。

表1 WB實(shí)驗(yàn)和IHC實(shí)驗(yàn)比較

IHC樣本類(lèi)型

IHC實(shí)驗(yàn)根據(jù)樣本類(lèi)型可以分為石蠟切片免疫組化(IHC-P)和冰凍切片免疫組化(IHC-F)，石蠟切片免疫組化雖然操作更加復(fù)雜，但其可以更好的保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，厚度更薄便于染色和觀(guān)察，以及可以常溫保存多年的優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)中更為常用。IHC-P和IHC-F的區(qū)別如下表：

表2 IHC-P和IHC-F實(shí)驗(yàn)比較

IHC實(shí)驗(yàn)流程

IHC-P由于前期需要用醛類(lèi)固定和石蠟包埋，因此前期樣品處理時(shí)需要有脫蠟復(fù)水和抗原修復(fù)的步驟，IHC-F則可以直接用OCT包埋劑包埋進(jìn)行切片和固定，可省略抗原修復(fù)的過(guò)程，后面的步驟基本一致。IHC-P的實(shí)驗(yàn)步驟如下圖所示：

PART 1 樣本制備

（篇幅有限，本文僅介紹樣本制備過(guò)程，后面的流程將在以后繼續(xù)介紹）
石蠟組織樣本的制備流程和冰凍組織樣本略有不同，步驟可參考下圖：
 

1、石蠟組織樣本：

（1）固定：可以使用4%多聚甲醛進(jìn)行在體灌流的方式，或者把組織取出之后，盡快放入4%多聚甲醛或者10%中性福爾馬林中進(jìn)行固定。固定液的體積一般為組織體積的20倍，固定時(shí)間為室溫4-48h。組織的體積不宜過(guò)大（不超過(guò)5*5mm2），以免影響后續(xù)的操作；

（2）脫水透明：使用梯度乙醇和二甲苯對(duì)樣品進(jìn)行脫水和透明處理。將組織修剪后置于脫水盒內(nèi)，依次放置于以下溶液中：75%乙醇（1h）——85%乙醇（1h）——95%乙醇（1h）——100%乙醇（50min）——100%乙醇（50min）——100%乙醇（50min）——二甲苯（40min）——二甲苯（40min）——二甲苯（40min）——63℃石蠟（50min）——63℃石蠟（50min）——63℃石蠟（50min）；

（3）浸蠟包埋：脫水結(jié)束后放入預(yù)熱的包埋機(jī)，按要求確定包埋方向進(jìn)行包埋，置于冷凍臺(tái)冷卻；

（4）切片：將修整好的蠟塊放入切片機(jī)中進(jìn)行切片，切片的厚度為3-5um，將切片漂浮于40℃溫水上展平組織，用粘附載玻片將組織撈起，置于60℃烘箱中進(jìn)行烤片1-2h；

（5）脫蠟復(fù)水：使用二甲苯和梯度乙醇進(jìn)行脫蠟和復(fù)水處理。將切片放置于切片架內(nèi)，依次分別置于以下溶液中：二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——100%乙醇（5min）——100%乙醇（5min）——95%乙醇（3min）——85%乙醇（3min）——75%乙醇（3min）——去離子水（5min)；

（6）抗原修復(fù)：

組織樣本在固定時(shí)形成的蛋白間交聯(lián)會(huì)限制抗體和抗原結(jié)合，需要通過(guò)抗原修復(fù)的過(guò)程使抗原暴露出來(lái)?？乖迯?fù)的方法一般分為熱修復(fù)和酶解修復(fù)。

熱修復(fù)：熱修復(fù)可使用微波爐或高壓鍋對(duì)樣品進(jìn)行加熱煮沸，常用的緩沖液為PH6的檸檬酸鹽或者PH8的EDTA緩沖液。熱修復(fù)適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，檸檬酸鹽較為溫和，更為常用；EDTA適用于多數(shù)磷酸化酪氨酸特異性抗體和較難檢測(cè)出的抗原。（具體修復(fù)液的選擇和處理時(shí)間參考一抗說(shuō)明書(shū)）

酶解修復(fù)：胃蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白酶K進(jìn)行酶解作用也可進(jìn)行抗原修復(fù)。酶解修復(fù)易受溫度影響，操作更難控制，一般適合于較難修復(fù)的抗原表位。
操作步驟：將切片置于切片架內(nèi)，放入裝有修復(fù)液的燒杯中，放入微波爐高火5-8min，常溫5min，中火5min，室溫冷卻30min。

2、冰凍組織樣本：

（1）OCT包埋：-80℃保存的組織提前半小時(shí)-20℃緩慢解凍后OCT包埋，固定組織經(jīng)蔗糖溶液脫水后進(jìn)行OCT包埋，新鮮組織濾紙吸干水分后可直接進(jìn)行OCT包埋。樣本脫上滴少量OCT后，將組織切面朝上置于樣本脫上，組織周?chē)紊螼CT包埋劑全部覆蓋組織，將樣本托放在速凍臺(tái)上快速冷凍包埋，大約冷凍10-20min，OCT變白變硬后即可進(jìn)行切片。

（2）切片：將樣本托固定于切片機(jī)上，先粗修將組織面修切平整修到目的觀(guān)察部位后即可開(kāi)始切片，將組織貼于防脫載玻片上，室溫晾干，37℃烤箱烘烤10-20min。

（3）固定：用4%PFA或者甲醇固定20min。