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PCR疑難解決辦法總結(jié)
問題1:不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶引物：引物質(zhì)量是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。對策為：①選定合適的引物合成單位；②引物的濃度不僅要看OD值，用引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)與引物合成單位協(xié)商解決，如一條引物亮度高，一條引物亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度；③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏而導(dǎo)致變質(zhì)降解失效；④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴(kuò)增是不會成功的。
問題2:出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶出現(xiàn)的原因：一是引物與靶序列不*互補，或引物聚合形成二聚體；二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。對策為：必要時重新設(shè)計引物；減低酶量或調(diào)換另一來源的酶；降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)；適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。
問題3:出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。可能由于Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多，GC含量過高引起。對策為：適當(dāng)降低Mg2+濃度；增加模板量；減少循環(huán)次數(shù)；加入添加劑甘油或Qiagen公司的Q-solution。
問題4:污染的監(jiān)測——對照試驗 1.陽性對照：應(yīng)設(shè)有陽性對照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要標(biāo)志。陽性對照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）。 2.陰性對照：每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括①標(biāo)本對照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照，被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照；②試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測試劑是否污染。 3.重復(fù)性試驗 4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
問題5:污染的處理（一）環(huán)境污染 1．稀酸處理法 2．紫外照射（UV）法（二）反應(yīng)液污染，可采用下列方法之一處理： 1．DNase I法 2．內(nèi)切酶法 3．紫外照射法 4．Gama射線輻射法（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴(kuò)增片段通常為300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。（四）固相捕獲法用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)。（五）RS-PCR法（RNA-specificPCR） 也稱為鏈特異性PCR，主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。（六）抗污染引物法該對引物擴(kuò)增時通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點，這一區(qū)域只存在于完整的原病毒中。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本，就不能擴(kuò)增出任何條帶，即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴(kuò)增，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。
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