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PCR疑難解決辦法總結(jié)

來源:上海嶸崴達(dá)實業(yè)有限公司   2012年03月15日 15:35  

                                  PCR疑難解決辦法總結(jié)

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問題1:不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶引物:引物質(zhì)量是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。對策為:選定合適的引物合成單位;引物的濃度不僅要看OD值,用引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應(yīng)與引物合成單位協(xié)商解決,如一條引物亮度高,一條引物亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度;引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏而導(dǎo)致變質(zhì)降解失效;引物設(shè)計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低擴(kuò)增的特異性,濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴(kuò)增是不會成功的。
問題2:出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致,或大或小,或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶出現(xiàn)的原因:一是引物與靶序列不*互補,或引物聚合形成二聚體;二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。對策為:必要時重新設(shè)計引物;減低酶量或調(diào)換另一來源的酶;降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù);適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法(93變性,65左右退火與延伸。
問題3:出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。可能由于Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多,GC含量過高引起。對策為:適當(dāng)降低Mg2+濃度;增加模板量;減少循環(huán)次數(shù);加入添加劑甘油或Qiagen公司的Q-solution。
問題4:污染的監(jiān)測——對照試驗 1.陽性對照:應(yīng)設(shè)有陽性對照,它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要標(biāo)志。陽性對照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,如以重組質(zhì)粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100個拷貝以下。 2.陰性對照:每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括標(biāo)本對照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照,被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照;試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNARNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以監(jiān)測試劑是否污染。 3.重復(fù)性試驗 4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
問題5:污染的處理(一)環(huán)境污染 1.稀酸處理法 2.紫外照射(UV)(二)反應(yīng)液污染,可采用下列方法之一處理: 1DNase I 2.內(nèi)切酶法 3.紫外照射法 4Gama射線輻射法(三)尿嘧啶糖苷酶(UNG)由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好,而臨床用于檢測的PCR擴(kuò)增片段通常為300bp左右,因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。(四)固相捕獲法用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)。(五)RS-PCR(RNA-specificPCR) 也稱為鏈特異性PCR,主要指用于RNA模板的特異性PCR法,該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。(六)抗污染引物法該對引物擴(kuò)增時通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點,這一區(qū)域只存在于完整的原病毒中。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本,就不能擴(kuò)增出任何條帶,即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶,其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴(kuò)增,因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽性的,該法試用于環(huán)狀靶分子系列。

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