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合成培養(yǎng)基的主要成分及配制步驟

來源:上海邦景實業(yè)有限公司   2024年07月22日 14:58  

        細胞培養(yǎng)基的種類很多,按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基(目前使用的培養(yǎng)基絕大部分是合成培養(yǎng)基),按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類。干粉培養(yǎng)基需由實驗者自己配制并滅菌,液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供,用戶可直接使用,非常方便。

一、合成培養(yǎng)基的主要成分有:氨基酸、碳水化合物、無機鹽、維生素及其它輔助物質(zhì):

  1、氨基酸

  氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細胞對氨基酸的要求各異,但有幾種氨基酸細胞自身不能合成,必須依靠培養(yǎng)液提供,這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺時,細胞生長不良而死亡。因此,各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺。但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,應(yīng)置于-20℃冰箱中保存,在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲存2 周以上時,還應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺。
 

  2、碳水化合物

  碳水化合物是細胞生長主要能量來源,其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。
 

  3、無機鹽

  培養(yǎng)液中無機鹽的主要功能是幫助細胞維持滲透壓平衡。此外,通過提供鈉,鉀和鈣離子,幫助細胞調(diào)節(jié)細胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個非常重要的因素, 細胞通??赡褪?60mOsm/kg ~320 mOsm/kg。標準培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動。特別注意:向培養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓,特別是溶于強酸或強堿中的物質(zhì)。向培養(yǎng)液中添加HEPES 時需按以下方法調(diào)節(jié)鈉離子濃度。
 

  大多數(shù)細胞所需pH 在 7.2 - 7.4。但是,細胞培養(yǎng)適pH 值隨培養(yǎng)的細胞種類不同而不同。成纖維細胞喜歡較高pH (7.4 - 7.7), 而傳代轉(zhuǎn)化細胞系則需要偏酸pH (7.0 - 7.4)。
 

  由于多數(shù)培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉(NaHCO3)與CO2 體系進行緩沖,因此,氣相中的CO2 濃度應(yīng)與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度相平衡。如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中CO2 濃度設(shè)定在5%,培養(yǎng)液中NaHCO3 的加入量為1.97g/L;如果CO2 濃度維持在10%,培養(yǎng)液中NaHCO3 的加入量為3.95g/L。
 

  細胞培養(yǎng)瓶蓋不應(yīng)擰得太緊,以保證氣體交換。HEPES 是一種非離子緩沖液,在pH 7.2 - 7.4 范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力,但是非常昂貴,在高濃度時對一些細胞可能有毒。HEPES 緩沖液可與低水平的碳酸鈉(0.34g/L)共用,以抵消因額外加入HEPES 引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下,細胞培養(yǎng)瓶的蓋子應(yīng)擰緊,以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作為pH 指示劑,酸性培養(yǎng)液呈橙黃色,堿性培養(yǎng)液呈深紅色。
 

  4、維生素

  在細胞培養(yǎng)中,盡管血清是維生素重要來源, 但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以適合更多的細胞系生長。
 

  5、其它成分

  在一些較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術(shù)中常用的DMEM 培養(yǎng)液,使用時還需要補加丙酮酸鈉和2-C2H6OS(2-Mercaptoethanol,2-Me)。2-Me 對細胞生長有很重要的作用。有人認為它相當于胎牛血清,有直接刺激細胞增殖作用。2-Me的活性部分是硫氫基,其中一個重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽,能誘導(dǎo)細胞的增殖,為非特異性的激活作用。同時避免過氧化物對培養(yǎng)細胞的損害。另一個重要作用是促進分裂原的反應(yīng)和DNA 合成,增加植物凝集素(PHA)對淋巴細胞的轉(zhuǎn)化作用,已廣泛應(yīng)用于雜交瘤技術(shù),另外,也開始用于一些難以培養(yǎng)的細胞。2-Me 是一種小分子還原劑,極易氧化。分子量為78.13,純的2-Me 是一種無色有刺激味的液體,比重為1.110-1.120(Do20),常用終濃度為5×10-5M。常配制成0.1M 的儲存液,用時每升培養(yǎng)液加0.5ml。


二、配制步驟
①、將干粉型培養(yǎng)基溶于欲配制液體總量2/3的三蒸水,沖洗包裝袋兩次倒入培養(yǎng)液中,加人磁性攪棒并置于磁力攪拌器上充分攪拌,以確保培養(yǎng)基干粉充分溶解。
②、按照產(chǎn)品包裝說明的要求和實驗需要補加 NaHCO3和谷氨酰胺。
③、加入抗生素:最終濃度為青霉素100U/mL,鏈霉素100ug/mL。(一般市售的青霉素為80萬單位/瓶,將其溶解于4 mL三蒸水中,每升培養(yǎng)液中加人0.5 mL;市售鏈霉素為1g/瓶,將其溶解在5mL中,每升培養(yǎng)液加人0.5 mL。)
④、加入所需濃度的經(jīng)56℃水浴滅活的胎牛(或其他)血清,補加三蒸水至最終體積。(目前,血清均經(jīng)過無菌處理。)
⑤、調(diào)整培養(yǎng)液pH值:一般情況下市售干粉型培養(yǎng)基溶解后,pH值都有一相對穩(wěn)定的數(shù)值,但某些因素例如配制液體使用的三蒸水、加人不同濃度的血清、采用CO2加壓過濾等,有可能使所配制液體的pH有所改變。因此,配制過程中,應(yīng)強調(diào)采用新鮮制備的三蒸水并在加人血清后調(diào)整pH值,過濾除菌時宜采用O2加壓過濾。常規(guī)配制培養(yǎng)液時pH值常略偏堿,可采用HCI溶液進行調(diào)整,使用時可將預(yù)先配制的HCI溶液逐滴緩慢加入欲調(diào)整的偏堿的液體中并攪拌均勻,用pH計或pH精密試紙觀察調(diào)整結(jié)果達到pH7.2~7.4。
⑥、將上述溶液用過濾法消毒除菌。所使用的濾器采用0.22 um和0.45 um濾膜各1張,常規(guī)高壓滅菌消毒。
⑦、將經(jīng)過濾除菌的培養(yǎng)液分裝于貼有標簽的無菌貯液瓶中,加蓋瓶塞,加封75%乙醇浸泡的玻璃紙,4℃存放。

三、注意事項
①配制培養(yǎng)液以及調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值所使用的HCl和 NaOH等溶液需新鮮制備的三蒸水,一般于配制當天制備,以保證水的純度和質(zhì)量。
②配制培養(yǎng)基的各種器皿都應(yīng)徹di清洗,烤干后備用。
③培養(yǎng)液配制過程中一般不需加熱助溶。
④培養(yǎng)液配制后應(yīng)進行無菌試驗,以檢測培養(yǎng)液是否有污染。配制培養(yǎng)液所需血清的質(zhì)量應(yīng)保持穩(wěn)定,同一項實驗應(yīng)盡可能采用同一批號血清。
⑤每批次配制液體數(shù)量以使用2周左右為宜,以免時間過長造成營養(yǎng)成分損失。


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