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免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之分型鑒定

來(lái)源:愛必信(上海)生物科技有限公司   2024年07月29日 13:30  

概述

 

免疫細(xì)胞培養(yǎng)的六個(gè)基本流程:樣本制備、細(xì)胞分選、分型鑒定、擴(kuò)增&培養(yǎng)、質(zhì)量?jī)?yōu)化、后續(xù)研究。小愛已經(jīng)給大家詳細(xì)介紹了《免疫細(xì)胞培養(yǎng)通關(guān)技巧之樣本制備》《免疫細(xì)胞培養(yǎng)通關(guān)技巧之細(xì)胞分選》,今天我們繼續(xù)一起學(xué)習(xí)分型鑒定的相關(guān)內(nèi)容。

 

分型鑒定(Phenotyping):利用細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行細(xì)胞鑒定,目前常用的方法是流式細(xì)胞術(shù)。

如果我們利用流式分選得到目的細(xì)胞,一般來(lái)說(shuō),分選后需要回測(cè)細(xì)胞進(jìn)行目的細(xì)胞的純度驗(yàn)證,即分型鑒定,也就是說(shuō)流式分選后目的細(xì)胞的分型鑒定與分選所用的細(xì)胞標(biāo)記物基本相同。

如果我們利用磁珠分選得到目的細(xì)胞,就意味著我們需要再設(shè)計(jì)一個(gè)流式實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分型鑒定。

 

方法

 

下面,小愛給大家介紹通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行免疫細(xì)胞分型鑒定需要確定的【六大方面】:

 

01 細(xì)胞數(shù)量

 

分選后的細(xì)胞懸液需要進(jìn)行計(jì)數(shù),一般為5~10*106/mL,確保有足夠的細(xì)胞數(shù)量可以上機(jī)。

 

02 細(xì)胞表面標(biāo)記物

 

細(xì)胞表面標(biāo)記物的重要性不言而喻,細(xì)胞分選時(shí)也會(huì)涉及到,分型鑒定時(shí)我們也需要通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)記物來(lái)進(jìn)行圈門邏輯的設(shè)置。需要注意的是,分型鑒定后的細(xì)胞需要進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng),不能選擇細(xì)胞的胞內(nèi)標(biāo)記物(胞內(nèi)檢測(cè)需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定破膜處理,最后得到的就是死細(xì)胞了)。

 

比如磁珠分選小鼠脾臟Treg細(xì)胞后進(jìn)行流式分型鑒定的圈門邏輯如下:

 

圖1 流式鑒定小鼠脾臟Treg細(xì)胞圈門邏輯

 

03 熒光素標(biāo)記

 

流式分選和流式鑒定的配色原則是一致的,抗體偶聯(lián)熒光素的選擇原則,小愛在【細(xì)胞分選】中已經(jīng)給大家匯總啦,小伙伴們按需查看。

 

04 死活染料

 

如果分選后的細(xì)胞立即進(jìn)行分型鑒定,一般不用染死活,凍存細(xì)胞建議加入死活染料染色。

 

目前流式用死活染料分為兩大類:胺基類染料、核酸類染料。兩者的原理、使用階段、對(duì)應(yīng)的特定通道小愛也給大家做了匯總。由于核酸類死活染料可選產(chǎn)品少,占據(jù)了一些重要的熒光通道,小愛也建議大家優(yōu)先抗體配色后進(jìn)行核酸類死活染料的熒光搭配選擇。

 

圖2 死活染料原理及對(duì)應(yīng)的特定通道

 

Tips:

① 使用FVS等胺基類染料時(shí),需要使用無(wú)疊氮鈉和無(wú)蛋白的DPBS溶液進(jìn)行洗滌和重懸細(xì)胞;

② 染完FVS之后,需要使用含有蛋白(FBS、BSA)的染色液洗滌兩次,使游離的FVS染料失效,便于后續(xù)染色;

③ 核酸類染料的加入為所有操作的最后一步,臨上機(jī)前5-10min加入即可,無(wú)需洗滌;

④ 核酸類染料與核酸空間共價(jià)結(jié)合,熒光弱,染色后,避免洗滌,劇烈渦旋或過(guò)度用力吹打,避免核酸類死活染料的脫落,導(dǎo)致假陰性;

⑤ 核酸類死活染料染色后,需及時(shí)上機(jī)(1h內(nèi)),避免染料的毒副作用導(dǎo)致額外的死細(xì)胞產(chǎn)生;

⑥ 核酸類死活染料4℃保存,不能凍存。

 

05 流式對(duì)照

 

流式對(duì)照對(duì)于實(shí)驗(yàn)的成功也是至關(guān)重要的,小愛表里也給大家列舉了一些對(duì)照的作用以及它們的應(yīng)用場(chǎng)景。

 

圖3 流式對(duì)照匯總

 

Tips:

Fc受體阻斷劑推薦使用,可減少抗原抗體的非特異性結(jié)合以及產(chǎn)生過(guò)強(qiáng)的背景信號(hào),可使用:

① 商業(yè)化Fc Block;

② 樣本種屬或流抗來(lái)源種屬的血清;

③ 樣本種屬或流抗來(lái)源種屬的IgG。

 

06 染色方案

 

染色方案也可通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定,主要是為了防止熒光選擇不當(dāng),導(dǎo)致染色信號(hào)過(guò)強(qiáng)或過(guò)弱。需要考慮的因素包括但不限于抗體用量、染色體積、孵育時(shí)間、孵育溫度、洗滌次數(shù)等。

 

Tips:

① 不同的檢測(cè)指標(biāo)、抗體品牌、熒光素標(biāo)記、抗體批次都會(huì)導(dǎo)致抗體的效價(jià)不同,要得到很優(yōu)質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果,我們要對(duì)每一個(gè)抗體進(jìn)行抗體滴定實(shí)驗(yàn)以確定最佳的抗體用量;

② 一般來(lái)說(shuō),染色體積不變,抗體用量不變(細(xì)胞數(shù)量10倍左右的浮動(dòng)范圍穩(wěn)定);染色體積增加,必須增加抗體用量以保持抗體濃度穩(wěn)定;

③ 染色體積一般為50-100μL;

④ 抗體孵育時(shí)間與溫度:一般常用的是4℃,30-60min,可減少非特異性結(jié)合,熒光很穩(wěn)定不易淬滅;臨床檢測(cè)一般常用室溫(20℃左右),15-30min;

⑤ 細(xì)胞離心,推薦300g-500g,5min,抗體的洗滌推薦直接使用流式管操作,1次洗液用量2mL;

⑥ 為了保證細(xì)胞的活力,染色后需盡快上機(jī)。

 

小愛給大家針對(duì)上述內(nèi)容做了重點(diǎn)匯總:

 

圖4 利用流式進(jìn)行免疫細(xì)胞分型鑒定重點(diǎn)總結(jié)

 

 寫在最后:

如果磁珠分選后的細(xì)胞我們不能立即進(jìn)行分型鑒定,那就涉及到細(xì)胞的保存以及活力測(cè)定。

短期保存:將分選得到的細(xì)胞用適量含10%-20%滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培養(yǎng)基重懸至合適密度,置于4℃保存。

長(zhǎng)期保存:液氮深低溫(-196℃)保存細(xì)胞,可加入10%二甲亞砜(DMSO)作為保護(hù)劑。

活力測(cè)定:很簡(jiǎn)便常用的方法為臺(tái)盼藍(lán)染色法。臺(tái)盼藍(lán)是一種陰離子型染料。這種染料不能透過(guò)活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜,故活細(xì)胞不著色;死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加,染料可通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,故死細(xì)胞著色呈藍(lán)色。

做好細(xì)胞的保存、復(fù)蘇及復(fù)蘇后的活力測(cè)定,就可以按照上面的步驟再通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞的分型鑒定了!

 

今天講解就到這了,下一個(gè)擴(kuò)增&培養(yǎng),我們不見不散呀!大家如有細(xì)胞培養(yǎng)問(wèn)題,歡迎一起交流哦!

 

本期小愛推薦

貨號(hào)

品名

規(guī)格

abs9358

PI染色液

10mL

abs9104

7-AAD

1mg

abs47047616

DAPI染色液

50mL

abs7011

25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(50mL,透氣蓋)

200個(gè)/箱

abs7033

細(xì)胞培養(yǎng)板(標(biāo)準(zhǔn)透明6孔板)

50個(gè)/箱

abs7054

25mL一次性血清移液管

200支/箱




 


Absin產(chǎn)品線:

爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè));細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒);化合物大包裝;輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...


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