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ELISA試驗手工洗滌操作解讀

來源:上海邦景實業(yè)有限公司   2024年07月30日 14:35  

       洗滌在ELISA試驗過程中雖不是一個反應步驟,但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA試驗就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的,而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來??梢哉f在ELISA試驗操作中,洗滌是最主要的關鍵技術。

       手工洗板人為因素比較大,實驗人員必須經驗豐富,洗滌次數要足夠,沖擊力又不要太大,加入的洗液量以剛滿反應孔為限,防止孔口內有游離酶未能洗凈,同時防止孔與孔之間液體交叉。洗滌結束后扣干亦非常重要,否則易造成假陽性。每次洗完板后,在吸水紙上輕輕拍干,拍板時要垂直,避免交叉感染。用力不能過猛,防止抗原抗體復合物脫離;吸水紙要一次性使用,應使用不易脫落碎屑的吸水紙為宜。酶結合物不耐干燥,特別在較高的溫度下更易失活,所以拍干的反應板應盡量縮短在空氣中暴露的時間,時間越長,吸光度值越低。

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手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種方法:

一、浸泡式

1.吸干或甩干孔內反應液;

2.用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后,即甩去);

3.浸泡,即將洗滌液注滿板孔,放置1~2分鐘,間歇搖動,浸泡時間不可隨意縮短;

4.吸干孔內液體。吸干應徹di,可用水泵或真空泵抽吸,也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干;

5.重復操作步驟3和4,洗滌3~4次(或按說明規(guī)定)。在間接法中如本底較高,可增加洗滌次數或延長浸泡時間。

微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的,非離子型洗滌劑既含疏水基團,也含親水基團,其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合,從而削弱蛋白質與固相載體的結合,并借助于親水基團和水分子的結合作用,使蛋白質回復到水溶液狀態(tài),從而脫離固相載體。

洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,其濃度可在0.05%~0.2%之間,高于0.2%時,可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。

二、流水沖洗式

流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌,洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置,使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗,持續(xù)沖洗2分鐘后,吸干液體,再用蒸餾水浸泡2分鐘,吸干即可。浸泡式猶如盆浴,流水沖洗式則好比淋浴,其洗滌效果更為徹di,且也簡便、快速。

已有實驗表明,流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓,讓水流沖擊板孔表面,洗滌效果更佳。


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