聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 是分子生物學(xué)領(lǐng)域功能強(qiáng)大的技術(shù)之一。實時熒光定量PCR 是在標(biāo)準(zhǔn) PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上演變而成，常用于定量樣本中的 DNA 或RNA。

利用熒光探針或熒光 DNA 結(jié)合染料，采用實時熒光定量PCR 儀檢測熒光并完成 PCR 反應(yīng)所需的熱循環(huán)，實現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的定量。利用序列特異性引物，可測定特定的 DNA 或 RNA 序列的拷貝數(shù)。通過檢測 PCR 循環(huán)的每個階段中擴(kuò)增產(chǎn)物的量，實現(xiàn)定量。如果樣本中存在高豐度的特定序列 (DNA 或 RNA)，則在早期循環(huán)中即可觀察到擴(kuò)增；如果序列較少，則在晚期循環(huán)中方可觀察到擴(kuò)增。

實時熒光定量 PCR 分析的部分實施需要經(jīng)過優(yōu)化以確保所有反應(yīng)參數(shù)均設(shè)置精確，從而獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，常見引物二聚體相關(guān)問題分析如下：

1、引物二聚體形成的原因

引物二聚體的形成是在實時熒光定量 PCR 設(shè)計和驗證過程中最常見的問題之一，當(dāng)引物對之間的部分序列存在同源性時，可形成引物二聚體。如果在 PCR 反應(yīng)過程中引物退火形成二聚體，則 TaqDNA 聚合酶可延伸二聚體，形成長于原始引物的產(chǎn)物，它可導(dǎo)致循環(huán)過程中更易出現(xiàn)退火錯誤。根據(jù)長度的不同，引物也可能出現(xiàn)自身折疊，由此與模板形成沖突。反應(yīng)的復(fù)雜性 (尤其在多重反應(yīng)過程中) 可使上述不良影響發(fā)生的幾率增加。

2、如何確定是否存在引物二聚體？

凝膠電泳是顯示引物二聚體的一種合適的方法。如圖 1所示，引物二聚體在凝膠的底部形成擴(kuò)散條帶，通常位100 bp 以下。在 PCR 過程中，二聚體的形成與模板的退火及延伸之間存在競爭作用。引物二聚體通常隨模板的減少而增加。單獨采用凝膠電泳分析進(jìn)行驗證的缺點在于，其靈敏度低僅達(dá)到納克級，因此可能無法得出結(jié)果。凝膠電泳分析的優(yōu)勢是當(dāng)解離曲線 (熔解曲線) 數(shù)據(jù)同時可用時，產(chǎn)物的大小有助于對結(jié)果進(jìn)行綜合解釋。

                                                                              圖1

解離曲線，又稱熔解曲線，是利用雙鏈 DNA 結(jié)合染料獲得的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)熱廊線。如果擴(kuò)增具有好的特異性，則實時熒光定量 PCR 板上每個反應(yīng)孔的解離曲線將出現(xiàn)一個較窄的單峰。引物二聚體的熒光強(qiáng)度較低，呈較寬的“波形”，顯示其在 70°C 左右熔解。出現(xiàn)此峰形和熔解溫度主要是由于引物二聚體的長度較小且不確定。若對解離曲線中是否存在引物二聚體有任何疑問，可將觀察的結(jié)果與 NTC（No Template Control，即無模板對照，是陰性對照）反應(yīng)孔相比較，當(dāng)模板不存在時，更易出現(xiàn)引物二聚體峰 (圖 2，熔解曲線中突出顯示了特異性擴(kuò)增 (圖2A) 和引物二聚體效應(yīng)(圖2B)?？衫?NTC 樣本在熔解曲線中產(chǎn)生多余的峰(圖2B) 識別出引物二聚體)。

3、如何減少或去除引物二聚體？

如果出現(xiàn)了引物二聚體，有許多方法可以減少或消除反應(yīng)中的引物二聚體。

（1） 首先是優(yōu)化熱循環(huán)條件，這主要是提高退火溫度。大多數(shù)情況下，兩步循環(huán) (由 95°C 變性步驟直接進(jìn)入60°C 退火和延伸步驟) 有利于強(qiáng)效擴(kuò)增，因此引物設(shè)計時設(shè)定的成功退火溫度為 60°C。

（2）可降低引物濃度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數(shù)情況下，每條引物的理想最終濃度為 200 nM，但如有需要，可將濃度降至 60 nM。

（3）鎂的最佳濃度一般約為 3 mM。高于此濃度易形成引物二聚體。

（4）如果未對引物形成二聚體的傾向進(jìn)行評估，則應(yīng)補(bǔ)充評估并考慮重新設(shè)計 (如有需要)。通常情況下，最好使用熱啟動 DNA 聚合酶，并在冰上進(jìn)行反應(yīng)。

（5）在理論上，針對同一靶點應(yīng)同時檢測多個引物組。這實際上可以節(jié)省大量時間，因為如果這些引物中的一個能立即發(fā)揮作用，則可以減少花費在優(yōu)化過程上的時間。