国产精品视频一区二区三区四,亚洲av美洲av综合av,99国内精品久久久久久久,欧美电影一区二区三区电影

產(chǎn)品推薦:氣相|液相|光譜|質(zhì)譜|電化學(xué)|元素分析|水分測定儀|樣品前處理|試驗機(jī)|培養(yǎng)箱


化工儀器網(wǎng)>技術(shù)中心>其他文章>正文

歡迎聯(lián)系我

有什么可以幫您? 在線咨詢

實時熒光定量PCR 引物二聚體相關(guān)問題解答

來源:上海邦景實業(yè)有限公司   2024年08月05日 13:51  

     聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 是分子生物學(xué)領(lǐng)域功能強(qiáng)大的技術(shù)之一。實時熒光定量PCR 是在標(biāo)準(zhǔn) PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上演變而成,常用于定量樣本中的 DNA RNA。

利用熒光探針或熒光 DNA 結(jié)合染料,采用實時熒光定量PCR 儀檢測熒光并完成 PCR 反應(yīng)所需的熱循環(huán),實現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的定量。利用序列特異性引物,可測定特定的 DNA RNA 序列的拷貝數(shù)。通過檢測 PCR 循環(huán)的每個階段中擴(kuò)增產(chǎn)物的量,實現(xiàn)定量。如果樣本中存在高豐度的特定序列 (DNA RNA),則在早期循環(huán)中即可觀察到擴(kuò)增;如果序列較少,則在晚期循環(huán)中方可觀察到擴(kuò)增。

實時熒光定量 PCR 分析的部分實施需要經(jīng)過優(yōu)化以確保所有反應(yīng)參數(shù)均設(shè)置精確,從而獲得準(zhǔn)確的結(jié)果,常引物二聚體相關(guān)問題分析如下


1、引物二聚體形成的原因

引物二聚體的形成是在實時熒光定量 PCR 設(shè)計和驗證過程中最常見的問題之一,當(dāng)引物對之間的部分序列存在同源性時,可形成引物二聚體。如果在 PCR 反應(yīng)過程中引物退火形成二聚體,則 TaqDNA 聚合酶可延伸二聚體,形成長于原始引物的產(chǎn)物,它可導(dǎo)致循環(huán)過程中更易出現(xiàn)退火錯誤。根據(jù)長度的不同,引物也可能出現(xiàn)自身折疊,由此與模板形成沖突。反應(yīng)的復(fù)雜性 (尤其在多重反應(yīng)過程中) 可使上述不良影響發(fā)生的幾率增加。

 

2、如何確定是否存在引物二聚體?

凝膠電泳是顯示引物二聚體的一種合適的方法。如圖 1所示,引物二聚體在凝膠的底部形成擴(kuò)散條帶,通常位100 bp 以下。在 PCR 過程中,二聚體的形成與模板的退火及延伸之間存在競爭作用。引物二聚體通常隨模板的減少而增加。單獨采用凝膠電泳分析進(jìn)行驗證的缺點在于,其靈敏度低僅達(dá)到納克級,因此可能無法得出結(jié)果。凝膠電泳分析的優(yōu)勢是當(dāng)解離曲線 (熔解曲線) 數(shù)據(jù)同時可用時,產(chǎn)物的大小有助于對結(jié)果進(jìn)行綜合解釋。

 

QQ截圖20240805133530.jpg

                                                                              1

解離曲線,又稱熔解曲線,是利用雙鏈 DNA 結(jié)合染料獲得的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)熱廊線。如果擴(kuò)增具有好的特異性,則實時熒光定量 PCR 板上每個反應(yīng)孔的解離曲線將出現(xiàn)一個較窄的單峰。引物二聚體的熒光強(qiáng)度較低,呈較寬的“波形”,顯示其在 70°C 左右熔解。出現(xiàn)此峰形和熔解溫度主要是由于引物二聚體的長度較小且不確定。若對解離曲線中是否存在引物二聚體有任何疑問,可將觀察的結(jié)果與 NTCNo Template Control,即無模板對照,是陰性對照)反應(yīng)孔相比較,當(dāng)模板不存在時,更易出現(xiàn)引物二聚體峰 (2,熔解曲線中突出顯示了特異性擴(kuò)增 (2A) 和引物二聚體效應(yīng)(2B)??衫?NTC 樣本在熔解曲線中產(chǎn)生多余的峰(2B) 識別出引物二聚體)

 

QQ截圖20240805133109.jpg

3、如何減少或去除引物二聚體?

如果出現(xiàn)了引物二聚體,有許多方法可以減少或消除反應(yīng)中的引物二聚體。

1) 首先是優(yōu)化熱循環(huán)條件,這主要是提高退火溫度。大多數(shù)情況下,兩步循環(huán) (95°C 變性步驟直接進(jìn)入60°C 退火和延伸步驟) 有利于強(qiáng)效擴(kuò)增,因此引物設(shè)計時設(shè)定的成功退火溫度為 60°C。

2)可降低引物濃度,甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數(shù)情況下,每條引物的理想最終濃度為 200 nM,但如有需要,可將濃度降至 60 nM

3)鎂的最佳濃度一般約為 3 mM。高于此濃度易形成引物二聚體。

4)如果未對引物形成二聚體的傾向進(jìn)行評估,則應(yīng)補(bǔ)充評估并考慮重新設(shè)計 (如有需要)。通常情況下,最好使用熱啟動 DNA 聚合酶,并在冰上進(jìn)行反應(yīng)。

5)在理論上,針對同一靶點應(yīng)同時檢測多個引物組。這實際上可以節(jié)省大量時間,因為如果這些引物中的一個能立即發(fā)揮作用,則可以減少花費在優(yōu)化過程上的時間。

 

 

 

 

 


免責(zé)聲明

  • 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
  • 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點和對其真實性負(fù)責(zé),不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時,必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
  • 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
企業(yè)未開通此功能
詳詢客服 : 0571-87858618
安阳县| 普洱| 东阳市| 正宁县| 伊宁县| 榕江县| 西昌市| 连江县| 航空| 仲巴县| 无为县| 牟定县| 肃宁县| 汕尾市| 新乐市| 渑池县| 德惠市| 泌阳县| 库车县| 凌源市| 桦甸市| 依安县| 马鞍山市| 象州县| 耒阳市| 华蓥市| 东莞市| 柳州市| 蒙阴县| 阿拉善盟| 东港市| 青龙| 宜川县| 兴国县| 句容市| 三亚市| 莎车县| 芜湖县| 双柏县| 霸州市| 榆树市|