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LncRNA數(shù)據(jù)深度挖掘工具——RIP技術(shù)

來源:愛必信(上海)生物科技有限公司   2024年08月06日 10:53  

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的RNA分子,通常不編碼蛋白,而是以RNA的形式在表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用,成為遺傳學(xué)研究熱點(diǎn)。

 

圖1 LncRNAs作用機(jī)制

 

一般來說,非編碼RNA功能研究的主線包含3個(gè)主要步驟:

 

高通量篩選:對(duì)收集的樣本進(jìn)行分組,采用高通量測(cè)序技術(shù)(如RNA-Seq)和相應(yīng)的特異性數(shù)據(jù)庫進(jìn)行高通量篩選,通過對(duì)轉(zhuǎn)錄本編碼潛能進(jìn)行篩選,判斷其是否具有編碼潛能,從而可以判定該轉(zhuǎn)錄本是否為lncRNA。

 

候選lncRNA的確定:識(shí)別不同樣品(或樣品組)之間顯著差異表達(dá)的基因或lncRNA,以獲取差異表達(dá)的候選RNA。在測(cè)序得到的非編碼RNA中,通常優(yōu)先選擇差異倍數(shù)大、表達(dá)水平高、且與研究方向相關(guān)的。

 

功能分析與驗(yàn)證:基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè),設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證非編碼RNA的生物學(xué)功能。比如通過實(shí)時(shí)定量PCR、原位雜交等技術(shù),驗(yàn)證RNA在特定樣本或條件下的表達(dá)情況。還可以通過基因敲除/敲減(如使用siRNA、shRNA或CRISPR/Cas9技術(shù)來降低lncRNA的表達(dá)水平)或者過表達(dá)實(shí)驗(yàn)(如通過構(gòu)建過表達(dá)載體提高lncRNA的表達(dá)水平)等觀察表型變化。要想進(jìn)行深層次的挖掘,可以研究其作用機(jī)制,RNA pull down、RIP、雙熒光素酶等實(shí)驗(yàn)技術(shù),檢測(cè)與目標(biāo)RNA相互作用的蛋白質(zhì)或RNA,進(jìn)一步揭示RNA的生物學(xué)功能。然后在動(dòng)物或細(xì)胞模型中驗(yàn)證RNA的功能和調(diào)控機(jī)制,進(jìn)一步確認(rèn)其在生理和病理?xiàng)l件下的重要性。

 

圖2 LncRNA研究思路

 

深入了解LncRNA作用機(jī)制能夠幫助我們識(shí)別疾病的潛在機(jī)制,以便尋找新的治療靶點(diǎn)。特別是在藥物研發(fā)中,許多藥物是通過干擾特定的RNA-蛋白質(zhì)相互作用來實(shí)現(xiàn)其治療效果的。

 

RIPRNA pull-down等實(shí)驗(yàn)技術(shù)是我們深入研究RNA和蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵工具。RIP運(yùn)用目標(biāo)蛋白的特異性抗體分離純化與蛋白相互作用的RNA,RNA pull-down通過RNA探針捕獲與之相互作用蛋白質(zhì)。今天帶大家了解一下RIP技術(shù),具體情況如下:

 

RIP技術(shù)(RNA Binding Protein lmmunoprecipitation,RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀),是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù),是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過程的有力工具。該技術(shù)主要是運(yùn)用目標(biāo)蛋白的特異性抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來,然后經(jīng)過分離純化對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證或高通量測(cè)序分析,主要進(jìn)行已知蛋白與已知RNA互作QPCR驗(yàn)證、已知蛋白與未知RNA互作二代測(cè)序篩選等。

 

圖3 RIP技術(shù)原理

 

愛必信abs50071 RNA免疫共沉淀(RIP)試劑盒提供全流程更詳細(xì)的使用說明,實(shí)驗(yàn)流程清晰明了!試劑盒內(nèi)自帶Normal Rabbit lgG、Normal Mouse lgG兩種對(duì)照IP抗體,真正的省心kit?。?!

 

圖4 abs50071 RNA免疫共沉淀(RIP)試劑盒IP后WB驗(yàn)證圖

 

常見問題:

 

1、RIP可以分提核漿的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物嗎?

理論上,可以采用能分別抽提核漿蛋白的蛋白抽提kit先分離樣本,再進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。但是所用kit中的試劑組分不能有RNase和DNase,以及要能與下游的抗體beads孵育兼容。

 

2、樣本中拉下的RNA濃度過低,如何改善?

可能的原因有:樣本量過少,考慮增加樣本初始量,另一個(gè)是裂解不充分,組織樣本未研磨充分等原因。

 

3、溶解曲線異常

出現(xiàn)非特異擴(kuò)增或有引物二聚體等情況,需重新設(shè)計(jì)引物。

 

4、IP和IgG樣本Ct值沒有什么差異,是什么原因造成的?

可能由于抗體沒有富集到RNA,可更換抗體嘗試;或者IgG背景過高,可增加洗滌次數(shù)或減少免疫沉淀步驟RNA投入量。

 

5、如何判斷RIP實(shí)驗(yàn)是否成功?

RIP后WB檢測(cè)IP組和input組檢測(cè)到目的蛋白信號(hào)即判斷RIP實(shí)驗(yàn)成功。

 

RIP實(shí)驗(yàn)相關(guān)好物推薦


貨號(hào)

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

abs50071

RNA免疫共沉淀(RIP)試劑盒

6T

abs60154

Trizol

100mL/500mL

abs60246

逆轉(zhuǎn)錄一管化三代預(yù)混液

100T

abs60086

SYBR High-Sensitivity qPCR SuperMix

1mL×5/1mL×25

abs9829

上樣緩沖液(5×)

10mL

abs9359

Tris-Glycine-SDS電泳緩沖液(10×)

500mL

abs9360

Tris-Glycine電泳緩沖液(10×)

500mL

abs923

預(yù)染蛋白Marker(10-245kDa)

500uL

abs924

預(yù)染蛋白Marker(10-180kDa)

250uL

abs931

PVDF膜(0.22μm)

1卷(30cm*3m)

abs932

PVDF膜(0.45μm)

1卷(30cm*3m)

abs959

NC膜(0.22μm)

1卷(30cm*3m)

abs960

NC膜(0.45μm)

1卷(30cm*3m)

abs9175

脫脂奶粉

500g

abs920

ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒

25mL×2




 

Absin產(chǎn)品線:

爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè));細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒);化合物大包裝;輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...


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