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LncRNA數據深度挖掘工具——RIP技術

來源:愛必信(上海)生物科技有限公司   2024年08月06日 10:53  

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是長度大于200個核苷酸的RNA分子,通常不編碼蛋白,而是以RNA的形式在表觀遺傳調控、細胞周期調控和細胞分化調控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用,成為遺傳學研究熱點。

 

圖1 LncRNAs作用機制

 

一般來說,非編碼RNA功能研究的主線包含3個主要步驟:

 

高通量篩選:對收集的樣本進行分組,采用高通量測序技術(如RNA-Seq)和相應的特異性數據庫進行高通量篩選,通過對轉錄本編碼潛能進行篩選,判斷其是否具有編碼潛能,從而可以判定該轉錄本是否為lncRNA。

 

候選lncRNA的確定:識別不同樣品(或樣品組)之間顯著差異表達的基因或lncRNA,以獲取差異表達的候選RNA。在測序得到的非編碼RNA中,通常優(yōu)先選擇差異倍數大、表達水平高、且與研究方向相關的。

 

功能分析與驗證:基于生物信息學預測,設計實驗來驗證非編碼RNA的生物學功能。比如通過實時定量PCR、原位雜交等技術,驗證RNA在特定樣本或條件下的表達情況。還可以通過基因敲除/敲減(如使用siRNA、shRNA或CRISPR/Cas9技術來降低lncRNA的表達水平)或者過表達實驗(如通過構建過表達載體提高lncRNA的表達水平)等觀察表型變化。要想進行深層次的挖掘,可以研究其作用機制,RNA pull down、RIP、雙熒光素酶等實驗技術,檢測與目標RNA相互作用的蛋白質或RNA,進一步揭示RNA的生物學功能。然后在動物或細胞模型中驗證RNA的功能和調控機制,進一步確認其在生理和病理條件下的重要性。

 

圖2 LncRNA研究思路

 

深入了解LncRNA作用機制能夠幫助我們識別疾病的潛在機制,以便尋找新的治療靶點。特別是在藥物研發(fā)中,許多藥物是通過干擾特定的RNA-蛋白質相互作用來實現其治療效果的。

 

RIPRNA pull-down等實驗技術是我們深入研究RNA和蛋白質相互作用的關鍵工具。RIP運用目標蛋白的特異性抗體分離純化與蛋白相互作用的RNA,RNA pull-down通過RNA探針捕獲與之相互作用蛋白質。今天帶大家了解一下RIP技術,具體情況如下:

 

RIP技術(RNA Binding Protein lmmunoprecipitation,RNA結合蛋白免疫沉淀),是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術,是了解轉錄后調控網絡動態(tài)過程的有力工具。該技術主要是運用目標蛋白的特異性抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來,然后經過分離純化對結合在復合物上的RNA進行q-PCR驗證或高通量測序分析,主要進行已知蛋白與已知RNA互作QPCR驗證、已知蛋白與未知RNA互作二代測序篩選等

 

圖3 RIP技術原理

 

愛必信abs50071 RNA免疫共沉淀(RIP)試劑盒提供全流程更詳細的使用說明,實驗流程清晰明了!試劑盒內自帶Normal Rabbit lgG、Normal Mouse lgG兩種對照IP抗體,真正的省心kit?。。?/strong>

 

圖4 abs50071 RNA免疫共沉淀(RIP)試劑盒IP后WB驗證圖

 

常見問題:

 

1、RIP可以分提核漿的RNA-蛋白質復合物嗎?

理論上,可以采用能分別抽提核漿蛋白的蛋白抽提kit先分離樣本,再進行RIP實驗。但是所用kit中的試劑組分不能有RNase和DNase,以及要能與下游的抗體beads孵育兼容。

 

2、樣本中拉下的RNA濃度過低,如何改善?

可能的原因有:樣本量過少,考慮增加樣本初始量,另一個是裂解不充分,組織樣本未研磨充分等原因。

 

3、溶解曲線異常

出現非特異擴增或有引物二聚體等情況,需重新設計引物。

 

4、IP和IgG樣本Ct值沒有什么差異,是什么原因造成的?

可能由于抗體沒有富集到RNA,可更換抗體嘗試;或者IgG背景過高,可增加洗滌次數或減少免疫沉淀步驟RNA投入量。

 

5、如何判斷RIP實驗是否成功?

RIP后WB檢測IP組和input組檢測到目的蛋白信號即判斷RIP實驗成功。

 

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貨號

產品名稱

規(guī)格

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RNA免疫共沉淀(RIP)試劑盒

6T

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Trizol

100mL/500mL

abs60246

逆轉錄一管化三代預混液

100T

abs60086

SYBR High-Sensitivity qPCR SuperMix

1mL×5/1mL×25

abs9829

上樣緩沖液(5×)

10mL

abs9359

Tris-Glycine-SDS電泳緩沖液(10×)

500mL

abs9360

Tris-Glycine電泳緩沖液(10×)

500mL

abs923

預染蛋白Marker(10-245kDa)

500uL

abs924

預染蛋白Marker(10-180kDa)

250uL

abs931

PVDF膜(0.22μm)

1卷(30cm*3m)

abs932

PVDF膜(0.45μm)

1卷(30cm*3m)

abs959

NC膜(0.22μm)

1卷(30cm*3m)

abs960

NC膜(0.45μm)

1卷(30cm*3m)

abs9175

脫脂奶粉

500g

abs920

ECL化學發(fā)光檢測試劑盒

25mL×2




 

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