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劃痕實驗(細胞遷移)的實驗流程詳述

來源:上海邦景實業(yè)有限公司   2024年08月12日 15:24  

      細胞遷移(Cell migration):因其類似體外傷口愈合過程,又名傷口愈合實驗(Wound healing assay),是指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動。它是一種廣泛建立的研究體外集體細胞遷移的技術(shù)。。細胞劃痕(Wound Healing)是一種操作簡單,經(jīng)濟實惠的研究細胞遷移/腫瘤侵襲的體外試驗方法。


      基本原理:在融合的單層細胞上人為制造一個空白區(qū)域,稱為“劃痕/傷口”,劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區(qū)域使“劃痕/傷口”愈合,于細胞遷移過程中在開始和定期捕獲圖像,通過測量不同時間點的劃痕間距并計算差值,可對細胞的遷移能力做出判斷。


       條件好的實驗室可以使用活細胞成像來分析創(chuàng)傷愈合實驗中角質(zhì)形成細胞或者成纖維細胞的遷移活動。結(jié)合包含的軟件分析算法,有可能延遲量化間隙表面關(guān)閉和關(guān)閉推移時間的速度。使用延時顯微鏡獲取數(shù)據(jù)的優(yōu)點是,可以在恒溫箱內(nèi)確定和穩(wěn)定的條件下記錄傷口分析。

   

       通常,用于傷口愈合試驗的細胞類型旨在重建表皮的再生特征。永生化的細胞系和原代細胞經(jīng)常被用作這方面的模型。蕞常用的細胞類型是角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞。


實驗前準備:

1.學(xué)習(xí):了解實驗的目的、實驗所用試劑耗材、實驗基本操作和注意事項、結(jié)果分析等。

2.耗材:六孔板、馬克筆、直尺、200ul槍頭、PBS、wan全培養(yǎng)基等。

3.規(guī)劃:根據(jù)所用細胞生長速度和所需定點拍照時間提前規(guī)劃實驗。建議在做實驗之前進行一次預(yù)實驗。


實驗步驟:  

1.劃線:于六孔板底面,馬克筆順直尺畫三條橫線作為標記線。

2.種板:根據(jù)分組種板,細胞密度為5x105個/孔左右。并務(wù)必鋪勻。

3.劃痕:待細胞長滿后,用直尺比著,200ul槍頭垂直于孔板和畫的標記線劃兩條垂線,使劃痕與標記線相交,可以形成若干交叉點,作為固定的檢測點。

4.清洗:棄去舊培養(yǎng)基,用PBS輕輕潤洗兩到三次,直到劃下來的細胞沖洗干凈。

5.加液:根據(jù)分組分別加入加藥培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基。

6.拍照觀察:劃痕、清洗、加液完成后,用顯微鏡拍不同倍數(shù)的照片,作為0h對照。放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在所需時間點取出細胞,于顯微鏡下觀察同一位置劃痕寬度并拍照。

7.數(shù)據(jù)分析:一種是統(tǒng)計細胞遷移的距離,一種是統(tǒng)計劃痕面積。都可以用ImageJ軟件來進行分析。


那么制作劃痕實驗需要注意事項:

1. 細胞的密度;劃痕實驗一般是幾種細胞的結(jié)合,但是每種細胞的生長速度會不一樣,所以需要按照細胞的生長特性調(diào)整培養(yǎng)時間,細胞鋪滿孔底時劃痕的效果會比較好,建議是100%的鋪滿。

2. 用槍頭畫線時盡量垂直,以6孔板為例 ,一個孔可以畫6條線

3. 畫線之后一定要用PBS洗兩次,以去除劃下的細胞

4. 注意培養(yǎng)方式一定要改成無血清或者低血清的培養(yǎng)基,因為:劃痕后用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,意在說明在監(jiān)測的 24 小時內(nèi),劃痕的縮小是細胞 遷移作用的結(jié)果,所以要將細胞增殖造成細胞遷移的影響降到蕞低;但若細胞改成無血清培養(yǎng)后大面積漂浮,需要適量加入血清濃度不能高于2%。

5. (5)放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱,培養(yǎng)。可按0,10,12,15時間點取樣,拍照(具體時間依實驗需要而定)。

6. (6)統(tǒng)計方法:使用Image J軟件打開圖片后,抓取自己畫的線條,計算細胞間距離的平均值。




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