UbcH5c TR-FRET檢測試劑盒是一種均勻、靈敏的TR-FRET（時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移）檢測試劑盒，旨在測量UbcH5b（泛素結(jié)合酶E2 D3）泛素化活性。該試劑盒使用生物素標(biāo)記的泛素和鋱標(biāo)記的抗體識別His標(biāo)記的UbcH5c蛋白，以完成TR-FRET配對。該試劑盒包含足夠的純化的UbcH5 c、純化的UBE1、生物素泛素、抗His-Tb標(biāo)記的供體、染料標(biāo)記的受體和400個反應(yīng)的測定緩沖液。

艾美捷UBCH 5c TR-FRET檢測試劑盒：

貨號: BPS-79901

檢測試劑盒格式: TR-FRET

物種: 人類

需自備材料:

能夠測量時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）的熒光微孔板閱讀器

可調(diào)節(jié)的微量移液管和無菌吸頭

軌道搖床

UniProt #UBE1: P22314; UBCH5c: P61077

儲存/穩(wěn)定性: 如果按照指示儲存材料，該檢測試劑盒從收到之日起最佳性能可維持長達(dá)6個月。

應(yīng)用: 篩選抑制Ubch5c活性的分子，在藥物發(fā)現(xiàn)高通量篩選（HTS）應(yīng)用中。

運(yùn)輸溫度: -80°C

禁忌: UbcH5c TR-FRET檢測試劑盒與高達(dá)1%最終DMSO濃度兼容。我們建議在U2檢測緩沖液中以不超過10% DMSO溶液準(zhǔn)備抑制劑，并每個孔使用2 μl。

避免凍融循環(huán)。

檢測協(xié)議：

所有樣品和對照應(yīng)進(jìn)行三次重復(fù)實驗。

檢測應(yīng)包括“空白”、“陽性對照”、“陰性對照”和“試驗抑制劑”條件。

我們建議在實驗過程中將稀釋后的蛋白質(zhì)保持在冰上。

我們推薦使用Bay11-7821作為內(nèi)部對照。如果不對控制抑制劑進(jìn)行劑量反應(yīng)曲線測試，我們建議按照下面驗證數(shù)據(jù)中顯示的IC50值的0.1倍、1倍和10倍來運(yùn)行控制抑制劑。

在冰上解凍UBE1、UbcH5c、U2檢測緩沖液、生物素-泛素和ATP。短暫離心管以回收全部內(nèi)容物。

將UBE1用U2檢測緩沖液稀釋至20 ng/µl（每個孔1.5 µl）。

將UbcH5c用U2檢測緩沖液稀釋至4 ng/µl（每個孔1.5 µl）。

將生物素-泛素用U2檢測緩沖液稀釋5倍（每個孔1 µl）。

準(zhǔn)備主混合物如下（每個孔5.5 µl）：N個孔 × （稀釋后的UBE1 1.5 µl + 稀釋后的UbcH5c 1.5 µl + 稀釋后的生物素-泛素1 µl + U2檢測緩沖液1.5 µl）。

向“陽性對照”、“陰性對照”和“試驗抑制劑”孔中各加入5.5 µl主混合物。

向“空白”孔中各加入5.5 µl U2檢測緩沖液。

準(zhǔn)備試驗抑制劑（每個孔2 µl）：對于滴定，準(zhǔn)備比期望最終濃度高10倍的連續(xù)稀釋。反應(yīng)的最終體積為20 µl。

向每個“試驗抑制劑”孔中加入2微升的抑制劑稀釋液。

向“陽性對照”、“陰性對照”和“空白”孔中各加入2微升的溶劑溶液。

將抗His標(biāo)簽的供體和染料標(biāo)記的受體各稀釋400倍，使用U2檢測緩沖液（每孔10微升）。這將制成供體/受體混合液。

向每個孔中加入10微升的供體/受體混合液。 注意：在添加底物（ATP）之前，考慮在室溫（RT）下進(jìn)行30分鐘的預(yù)孵育步驟。

通過向“空白”、“試驗抑制劑”和“陽性對照”孔中各加入2.5微升4毫米ATP來啟動反應(yīng)。

向“陰性對照”孔中加入2.5微升U2檢測緩沖液。

避免光照，并在室溫下孵育反應(yīng)30分鐘，或進(jìn)行長達(dá)1小時的動力學(xué)分析。

使用能夠測量TR-FRET的微孔板閱讀器讀取熒光強(qiáng)度。

應(yīng)從所有其他值中減去“空白”值。

UBCH 5c TR-FRET檢測試劑盒示例結(jié)果：

圖:Bay11-7821抑制了UbcH5c的活性。在Bay11-7822濃度增加的情況下測量了UbcH5的活性（Tocris#1744）。結(jié)果表示為相對于陽性對照的活性百分比（在沒有抑制劑的情況下測量，設(shè)置為100%）。